居室装修所致空气污染是影响人体健康的重要环境因素之一,其主要污染物是甲醛和苯^{〔1, 2, 3〕}。研究发现,甲醛或苯暴露可致生殖机能下降和生殖器官重量减轻,精子数量减少、畸型率增加、精子酶学发生改变以及睾酮含量下降^{〔4, 5〕};室内空气中各种化学毒物常混合存在,特别是甲醛和苯,故本研究采用甲醛和苯联合染毒方法,观察小鼠生殖毒性指标,探讨联合毒性作用类型和机制,为评价甲醛和苯的毒性提供实验依据。

苯、甲醛为国产分析纯;总抗氧化能力(T-AOC)、Na⁺-K⁺-ATP酶、Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶、Ca²⁺检测试剂盒和蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程研究所)。分别以食用油、生理盐水为溶剂。

108只SPF级健康性成熟昆明种雄性小鼠(南华大学动物中心),合格证书为SCXK(湘)2004-0009;平均体重(35±5.3)g。

按3×3析因设计要求,随机分为9组,每组12只。分别为对照组、甲醛5,20mg/kg、苯100,400mg/kg、苯+甲醛100+5、400+5、100+20、400+20mg/kg组。灌胃染毒5d,第35d颈椎脱臼处死小鼠,取睾丸和附睾,计算脏器系数,取附睾观察精子死亡率和畸型率^〔6〕;每组6只鼠睾丸做病理切片,观察形态结构;另6只鼠睾丸在冰浴下匀浆,过滤、离心15min,取上清液检测T-AOC、Ca²⁺含量、Na⁺-K⁺-ATP和Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶活性,沉碴细胞用于检测睾丸细胞凋亡。

取沉碴细胞,加入4℃氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液1mL制成睾丸细胞悬液,取0.5mL置于玻片上,在暗室下加等量吖啶橙/溴乙锭(AO/EB)染液,混匀,荧光显微镜观察,每只鼠观察500个细胞,计算睾丸细胞凋亡率。

采用考马斯亮兰法对匀浆液进行蛋白定量,T-AOC、Ca²⁺含量、Na⁺-K⁺-ATP和Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶的检测按照试剂盒说明书进行。

采用SPSS 13.0软件进行3×3析因设计的方差分析,组间比较采用最小显著差法(LSD),直观分析判断二者联合作用类型。

表 1

表 1 苯和甲醛对小鼠睾丸脏器系数和精子影响 (%, x ± s)

表 1 苯和甲醛对小鼠睾丸脏器系数和精子影响 (%, x ± s)

小鼠睾丸脏器系数随染毒剂量增加而降低,存在一定的剂量-效应关系。苯和甲醛染毒组及二者联合染毒组精子死亡率、畸型率、睾丸细胞凋亡率均高于对照组(P<0.01),剂量-效应关系明显。

表 2

表 2 苯和甲醛对小鼠 T-AOC、ATP酶活性、Ca2+含量的影响 ( n = 6, x ± s)

表 2 苯和甲醛对小鼠 T-AOC、ATP酶活性、Ca2+含量的影响 ( n = 6, x ± s)

不同剂量染毒组小鼠睾丸的T-AOC、Na⁺-K⁺-ATPse、Ca²⁺-Mg²⁺-ATPse活性随染毒剂量增加而降低,高剂量单独染毒组和联合染毒组下降更明显,Ca²⁺含量随染毒剂量的增加而增高,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。

表 3

表 3 苯和甲醛对小鼠睾丸T-AOC、ATP酶、Ca2+含量影响

表 3 苯和甲醛对小鼠睾丸T-AOC、ATP酶、Ca2+含量影响

甲醛与苯合用的毒效应大于二者单独作用的效应之和,甲醛和苯联合对T-AOC、ATP酶、Ca²⁺效应属于协同作用。

对照组睾丸结构正常;苯、甲醛各染毒组曲细精管形态不规则,边缘不完整,大小不一,管腔偏位,管腔内隐约可见少量发育成熟的精子,管壁细胞排列不紧密,精原母细胞、初、次级精母细胞变性损害,层次不清;染毒浓度越高,病理损害越明显。

T-AOC是机体总抗氧化能力指标,是机体抗氧化自由基的主要体系^〔7〕,可综合反映组织抗氧化系统清除自由基和防止氧自由基对组织损伤的能力,苯和甲醛能降低睾丸总抗氧化能力,导致小鼠睾丸组织发生脂质过氧化损伤、生殖细胞发育畸型甚至死亡。Na⁺-K⁺-ATP酶和Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶是ATP酶系的主要成员,是哺乳动物进行细胞内外Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺离子转运的跨膜载体蛋白,也是细胞膜上的活性基团,常是外源性化学物攻击的主要靶位点^〔8〕。ATP酶参与细胞氧化磷酸化与光合磷酸化反应,合成ATP,为生命活动提供能量;调节细胞内外Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺离子平衡,维持细胞正常的电位变化和内环境的稳定。苯和甲醛对小鼠睾丸Na⁺-K⁺-ATP酶和Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶有协同抑制作用,从而对细胞膜电位的产生、细胞渗透压的调节、某些营养物质的转运分解以及神经冲动传导等方面构成影响,干扰睾丸生殖细胞和精子的正常发育和成熟。钙离子是细胞内第二信使,是维持细胞内各项代谢活动所必须的,细胞内外钙稳态是钙发挥生理效应的关键。本研究发现苯和甲醛可使睾丸的钙含量增高,表明苯和甲醛干扰睾丸细胞内Ca²⁺转运造成Ca²⁺超载,从而导致细胞结构损伤和功能代谢障碍。有研究显示,钙超载是一切细胞不可逆损伤的最终通路^〔9〕,钙在睾丸细胞内蓄积可以激活caspase-12^〔10〕,启动睾丸细胞凋亡。