传统的微量病原检测主要有直接检测法和培养基富集后检测法,前者由于病原含量低、样品杂质存留多等问题,检测灵敏度较低;后者流程繁琐、耗时费力,不能用于快速检测。而在常规PCR和ELISA基础上衍生出的新技术已广泛应用于各个领域,但这些技术几乎都集中在病原的检测部分而忽略了检测之前的富集过程,造成许多微量病原的漏检。病原富集技术就是将大体积样品中含量很低的病原通过增菌、分离、浓缩等方法全部富集到可供检测的小体积样品中,从而增加单位体积样品中的病原数量,除去了某些干扰检测的成分,提高检测灵敏度^〔1〕。本研究就近年来新发展的微量病原富集技术研究进展作一综述。

1 选择性培养富集法 1.1 细菌富集

在含有微量病原的样品检测之前根据不同病原的不同生理状态选择不同的培养基培养,然后通过分子生物学或免疫学的方法进行检测,可以明显提高检测的灵敏度。这种方法已经广泛地应用于各种微量病原的富集中,尤其是近年来通过改进培养基的某些成分或添加选择性抗生素来提高病原富集效率的报道逐渐增多。Weber等^〔2〕研究了在缓冲蛋白胨水(BPW)培养基中添加8-羟基喹啉、柠檬酸铵、去氧胆酸钠、丙酮酸钠可以提高肠道菌群的富集效果。 Badosa等^〔3〕通过改变肠道李斯特菌和沙门菌的国际通用培养富集方法,证明了改良后的RV培养基在检测新鲜水果和蔬菜中的病原比MK-Tn和Sc肉汤对肠道细菌的增菌效果更好。选择性培养基富集法的结果比较准确,而且能检测出有致病力的活菌,被认为是金标准,但培养步骤时间较长、操作程序繁琐、耗时费力。

1.2 病毒富集

传统的病毒富集方法是将病毒转导入一定的细胞系中,通过细胞培养进一步分离,然后用特异性的血清中和试验鉴定病毒。这种方法的诊断比较准确,但时间较长,通过噬菌斑试验需要数周时间才能检测到病毒或者观察到细胞病变的效应,而且有些病毒如肠道病毒、诺瓦克病毒、轮状病毒和甲肝病毒是很难或者不可能通过细胞培养分离的。Loginova等^〔4〕用细胞冻融提取物对鸡胚培养的流感病毒进行预处理,富集了H1N1流感病毒,证明了刚上市的新药Ingav-irin对H1N1流感病毒具有较高抑制率。

2 吸附洗脱法 2.1 固定吸附

金属氢氧化物表面的羟基基团可与某些病原细胞表面的配体非特异性结合,因此可以用于病原的固定吸附。Schindler等^〔5〕用羟基磷灰石作为固相载体吸附细菌,然后通过光自动扫描系统进行检测,这种检测方法可在1 h内完成。金属氢氧化物富集后也可以通过平板计数法检测。此外,氢氧化锆、氢氧化钛、聚左旋赖氨酸或戊二醛连接的微量滴定板、聚乙烯亚胺包被的聚丙烯酰胺珠、植物凝集素连接的琼脂糖珠、氰根溴化物活化的琼脂糖珠、离子交换凝胶、碳化二亚胺包被的羟甲基纤维素和羧基末端琼脂糖珠等也可以作为病原富集的吸附载体。固定吸附法具有快捷、高效、廉价等优点,但这种富集方法没有特异性。

2.2 煤炭吸附

由于煤炭孔隙发达、价格便宜等优点,在化工、食品、冶金、环保等领域已有广泛的应用,也可以用于大体积样品中微量病原的浓缩。Dafale等^〔6〕用1.5g 120孔的煤粉制成的煤床从200 mL水样中富集浓缩了大肠埃希菌噬菌体,然后用3%的絮凝性牛肉浸膏洗脱、回收病毒,平均回收率为78.74%,应用该方法在印度那格浦尔市的井水监测中,发现每升水中大肠埃希菌噬菌体含量为2~28PFU/L。此外,粒状活性炭填充的滤柱也可用于饮用水中肠道病毒、戊型肝炎病毒和轮状病毒的吸附^〔7〕。煤炭吸附法操作简单,费用较低,适用于大体积样品中的病原富集,例如污水处理等,但也存在洗脱液中某些成分不能完全从浓缩物中消除的问题。

2.3 特异性细胞吸附

某些细胞表面的受体对病毒有高度的亲和力,病毒与相应的受体结合具有较高的特异性。曾显营等^〔8〕利用禽流感病毒能够吸附鸡红细胞并在一定条件下解离的特点,用鸡红细胞对已确诊的样品进行富集,然后用多重RT-PCR检测富集产物,结果与常规病毒分离结果完全一致,但检测时间明显缩短。细胞吸附法可以浓缩样品中的病毒,去除没有血凝性的病原和核酸抽提过程中的抑制性物质,进一步增加了检测的特异性。

3 膜过滤法 3.1 微孔滤膜

微孔滤膜只允许较小的分子通过,因此可以用于截留浓缩一定体积大小的病原;带有电荷的滤膜可以和带有相反电荷的病原通过静电引力结合也可以达到浓缩病原的目的。Kar in等 9 采用新的正电荷滤膜从大体积水中富集了脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃柯病毒,3种病毒的回收率分别为54%,27%,32%。Fuhrman等^〔10〕采用阴离子滤膜过滤富集小体积天然水中的肠道病毒,结果在新鲜水中的回收率为51%,在污水中的回收率为23%。由于带有电荷的滤膜价格昂贵,新近发展的NanoCeram筒式滤膜较为经济,可以作为水质中微量病毒监测的常规方法^〔9〕。也有研究者^〔11〕采用不带电荷的孔径为0.45 m的滤膜从原料乳中过滤收集菌体,随后进行PCR检测,整个检测过程可在6.5 h内完成,且检测灵敏度可达到100 CFU/mL,与经过预增菌后的 PCR和免疫磁珠法实时PCR技术达到相同灵敏度。膜过滤法具有高效、便捷、截留率高、可连续操作、处理量大等其他方法不能相比的优势,但病原的回收率一般较低,受洗脱液的影响也较大,可造成一定量的病原丢失,鉴于此,有研究者开发了环流微孔滤膜富集水样中的大肠埃希菌,细菌的回收率达 90%以上^〔12〕。

3.2 纤维玻璃滤膜

纤维玻璃滤膜由于其特有的分子结构可以用于病毒的浓缩富集。Lambertini等^〔13〕使用玻璃棉滤膜从饮用水中浓缩富集了脊髓灰质炎病毒、科萨奇病毒、埃柯病毒、腺病毒、诺若病毒,5种病毒的回收率分别为70%,14%,19%,21%,29%。用此方法在污水、饮用水、地下水、河水和水库水中对病毒进行了浓缩和富集,均显示出很好的富集效果。玻璃滤膜价格便宜,已经广泛应用于实验室中病原的过滤,而且还可以半自动化。

4 磁珠分离富集法

磁珠具有一定的磁性,在外加磁场的作用下可以定向迁移,向没有磁场的样品中加入磁珠时,磁珠分散并能与样品充分混合,当在样品管一侧添加磁场时,磁珠能迅速迁移并吸附在靠近磁场的管内壁上,移除多余样品后即可将病原富集。磁珠按照连接的不同捕捉分子可分为免疫磁珠、噬菌体磁珠、 CBDs磁珠、适配子磁珠、寡核苷酸磁珠等。

4.1 免疫磁珠

免疫磁珠富集分离的基本原理是利用外有功能基团可结合抗体的磁珠作为抗体的载体,用单克隆或多克隆抗体作为捕捉分子,当磁珠上的抗体与相应的抗原结合后形成磁珠-抗体-抗原免疫复合物,这种复合物在磁铁磁力的作用下定向移动能与其他物质分离,从而达到富集病原的目的。Gamble等^〔14〕用多克隆抗体包被磁珠,用于葡萄卷叶病毒的富集,结果在葡萄叶组织提取物稀释10和100倍后仍能检测到PMW aV-1,PMW aV-2和PMW aV-3病毒,在回顾性检测已确诊的42个样品中,准确率为100%。Yao等^〔15〕分别用单克隆抗体和多克隆抗体包被磁珠,用于检测粪便样品中的诺如病毒-II。结果表明,单抗包被的效果是多抗包被的100倍,是核酸提取方法的1000倍。Conlan等^〔16〕用多克隆抗体包被磁珠作为ELISA中抗原抓捕的固定点用于猪脾匀浆中猪瘟病毒的检测,结果检测灵敏度比用微孔板作为抓捕材料提高了64倍,诊断的特异性为100%。近年来,免疫磁珠法在国内也得到了较大发展,广泛应用在金黄色葡萄球菌、致病性大肠埃希菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌等多种病原的富集中^〔17〕。免疫磁珠法是近几年来发展最迅速、应用最广泛的病原富集法,其主要优点是可以明显缩短检测时间,但也存在一些问题,如抗体包被的磁珠间可能发生凝集反应;富集效率还受磁珠大小的影响,小磁珠分布均匀,但回收较难,大磁珠分离简单,但易形成沉淀,需适当搅拌才能保持悬浮状态。

4.2 磁珠免疫PCR

磁珠免疫PCR借助于磁珠的有效富集能力和免疫PCR技术的高敏感性及特异性,从而更敏感地检测微量病原。具体方法是首先在磁珠上连接链霉亲和素,然后将特异性抗体生物素化,再将生物素化后的抗体与链霉亲和素化的磁珠连接形成磁珠-抗体的复合物。将此复合物与待检病原及一段DNA标记的检测抗体进行孵育后,利用磁场分离富集病原,洗脱后把磁珠-病原-DNA标记抗体复合物全体转移到PCR反应体系中,以检测抗体上标记的DNA为模板进行PCR扩增检测。Wacker等^〔18〕用磁珠免疫PCR (M-IPCR)检测人血清中的乙肝表面抗原(HBsAg),并与磁珠酶联免疫吸附试验(M-EL ISA)进行比较,结果M-IPCR的检测下限为320 pg/mL,M-EL ISA的检测下限为40 ng/mL,M-IPCR法敏感性比对照组高125倍。磁珠免疫PCR是一种新的病原富集方法,其检测灵敏度较高,可以检测低于常规方法检测极限的微量病原。

4.3 噬菌体磁珠法

噬菌体不仅在其表面含有靶细菌的特异性单链抗体而且在其蛋白质外壳内含有编码该抗体的 DNA。因此,可以利用表面展示有单链抗体的噬菌体特异性识别目标抗原,然后利用噬菌体内部的DNA作为模板进行核酸扩增,把噬菌体作为载体直接介导完成免疫识别和信号检测过程。Loessner等^〔19〕综述了噬菌体及噬菌体衍生技术在食源性细菌检测上的应用,并提出噬菌体能够快速准确地鉴别出有活性的细菌,检测灵敏度极高,有些甚至达到2个细菌/mL。郭永超等^〔20〕运用该方法成功地对汉坦病毒核蛋白和朊病毒蛋白进行检测,并将噬菌体免疫PCR申请了专利。噬菌体磁珠法和磁珠免疫PCR具有同样高的检测灵敏度,但用噬菌体代替免疫PCR中的DNA分子,不仅能够增加检测稳定性而且减少检测成本,但也存在噬菌体导致病原细胞溶解或遗传物质降解的问题。

4.4.CBDs磁珠法

噬菌体感染细菌后,在噬菌体增殖周期的后期开始释放细胞内溶素,细胞内溶素有2个独立的结合域组成,一个是位于N端的酶活性域,另一个是位于C端的细胞壁结合域(cellwal-lbinding do mains,CBDs)。细胞壁结合域(CBDs)的本质为一段多肽,具有特异性识别靶细菌的功能。利用分离纯化后的这一段细胞壁结合域多肽包被磁珠,可以用于病原菌的富集分离,偶联后的复合物既有细胞壁结合域对病原菌识别的高特异性又有磁珠分离的快速性,可以较快地达到富集病原的目的。Kretzer等^〔21〕纯化了噬菌体高亲和力的细胞壁结合域(CBDs),然后将其包被在磁珠上,用于富集李斯特菌,回收率为86%~99%,经过24 h培养后,检测下限为0.1 CFU/g。研究者还将该方法用于牛奶、火鸡胸、碎肉、熏鱼、奶酪、莴苣等食品中的病原富集上,均显示出很高的灵敏度。CBDs磁珠除适用于李斯特菌外,也可以应用于蜡样芽孢杆菌、产气荚膜杆菌的富集分离,同时也表明了这种方法有着更广泛的应用范围。CBDs磁珠法是新发展的一种病原富集方法,与已经广泛使用的免疫磁珠法相比更少出现交叉反应,特异性更高,而且生产工艺简单。

4.5 适配子磁珠法

适配子是从随机单链寡核酸库中筛选出的与靶物质具有特异性高亲和力的寡核苷酸。适配子与靶物质的结合方式同抗原-抗体反应相似,同抗体一样具有高度识别并结合靶物质的能力,和磁珠偶联后可以作为病原富集的捕捉分子。Joshi等^〔22〕报道了应用肠道血清型沙门菌的特异性适配子与磁珠连接,在病原水平较低的情况下抓捕并检测到沙门菌,检测下限为101~102 CFU/9mL。Lee等^〔23〕 用大肠埃希菌特异性抗体包被磁珠抓捕抗原,再用适配子作为检测分子结合病原,热裂解后以适配子为模板进行实时反转录PCR,检测结果为10 CFU/mL。这种方法避开了样品制备过程中靶核酸的损失,增加了放大效应,而且适配子具有价廉、分子量小、适用范围广,变性可逆、可长期保存、可化学合成和修饰等优点,但同种适配子因竞争性地结合抗原的相同部位,不能同时发挥捕捉和检测两方面的作用。因此,需要2种不同位点的适配子共同参与才能同时完成病原的富集和检测。

4.6 寡核苷酸磁珠法

某些寡核苷酸具有特异识别病原核酸的作用,将生物素化后的寡核苷酸探针与链霉亲和素化的磁珠连接,再将此复合物与样品中的核酸杂交,用磁珠浓缩和纯化核酸,然后加入特异的引物,进行PCR扩增。由于寡核苷酸价格便宜,抓捕效率较高,已经广泛地应用于临床领域病原的检测上。Laschi等^〔24〕用链霉亲和素化的磁珠连接生物素化的DNA、肽核酸(PNA)和锁核酸(LNA)作为抓捕探针,然后通过电极表面的酶产物等电化学方法检测。Berti等^〔25〕用同样的方法制成了生物素化的寡核苷酸探针和链霉亲和素化的磁珠多通道生物传感器。结果表明,这种方法甚至比抗体或适配子连接的磁珠效果更好。

5 免疫捕捉PCR

免疫捕捉PCR是将免疫学和PCR技术结合起来的病原富集检测技术。具体过程是用制备好的抗体包被于PCR管内壁,捕捉目标病原,然后清洗未吸附的非特异性病原及其他成分,再进行各种PCR检测。如刘箐等^〔26〕用免疫捕捉PCR法检测西瓜果斑病菌,并与直接PCR法进行了比较。结果直接PCR的检测限度为103~104 CFU/mL,而免疫捕捉PCR的限度为101~102 CFU/mL,表明免疫捕捉PCR在病原富集和检测方面具有较好的敏感性和特异性。免疫捕捉法可以消除 PCR抑制剂的影响,稳定细菌或病毒中的核酸,提高检测的灵敏度,是一种简单而又实用的微量病原富集方法。

6 荧光纳米微球法

荧光纳米微球上可以高密度地排列大量的核酸探针捕获分子,每个荧光微球表面能够有效地共价结合1~2×10⁶个探针分子,将此微球与待检病原反应后,加入合适的报告分子,再用2束不同波长的光照射该体系,一束光用来激发荧光微球自身的荧光物质,根据探测到的荧光强度可以对探针分子进行定性检测;另一束光用来激发报告分子所携带的荧光物质,根据荧光强度可以对待检病原进行定量检测。因此,用荧光标记的抗体或其检测分子连接到带有荧光的纳米微球上可用于微量病原的富集和检测。Wang等^〔27〕制备出了具有共同激发波长的系列荧光纳米颗粒,然后用相应的特异性抗体包被这些荧光纳米颗粒,成功地富集和检测了大肠埃希菌、鼠伤寒沙门菌和金黄色葡萄球菌。

7 芯片介电电泳

处于非均匀电场中的微粒由于极化效应而产生运动,这种现象称之为介电电泳。芯片介电电泳是以介电电泳分离原理和微机电加工技术为依托发展起来的可用于生化样品分析的新型分析技术。芯片介电电泳在病原的富集检测上已经有着广泛的应用。Suehiro等^〔28〕将抗体固定到叉指电极式介电电泳芯片表面,利用抗原和抗体的特异性吸附作用使靶细胞与固定在芯片表面的抗体结合,实现了2种特定细胞的流动式介电富集过程。Lapizco-Encinas等^〔29〕对有活性和失活的大肠埃希菌的混合样品进行了连续富集和分离,并用这种方法从污水中分离出了大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌、烟草花叶病病毒等。芯片介电电泳具有的高效、高分辨率、低污染、信息丰富等优点,将介电电泳技术与其他免疫学、分子生物学检测技术结合,可以极大提高介电电泳分离富集过程中的选择性。

8 展望

近几年国内外发展了多种用于微量病原富集的方法,其中免疫磁珠应用最广,目前越来越多的研究者将免疫磁珠分离技术与ELISA、PCR、RT-PCR、巢式PCR、实时PCR等检测技术结合起来对病原进行富集和检测^〔17〕。但免疫磁珠价格较贵,如能开发出能反复利用的免疫磁珠则能极大地节约检测成本。噬菌体及噬菌体的衍生物磁珠法是近几年来发展的新技术,有望逐渐成为病原富集的重要手段^〔19〕,但噬菌体技术目前仍然处于研究阶段,而且商品化的噬菌体及噬菌体衍生物很少,如能将噬菌体磁珠或CBDs磁珠法与实时PCR或其他新的检测技术结合起来可能会更大地增加检测的特异性和快速性。适配子是新发现的一类短肽,目前主要应用于临床领域中疾病的诊断和治疗,显示出很高的特异性和敏感性,但是用适配子磁珠法富集病原的报道目前还很少,如能开发出更多的病原特异性适配子及连接适配子的载体,将更进一步提高微量病原的检测灵敏度。生物芯片是近年来影响最深远的重大科技进展之一,它是以某种特定的支持物为载体,在单位面积上高密度地排列大量的生物捕获分子(核酸探针、抗体等),可以直接用于病原的富集检测,目前生物芯片技术在病原富集上的应用还不太成熟,商品化的很少。其他高新技术在病原富集上的应用也逐渐增多,有研究者^〔30〕 开发了表面等离子共振生物传感器、光纤传感器、压电晶体免疫传感器、高弥散碳颗粒等纳米和微电子技术用于病原的富集,均显示出很高的敏感性。随着技术的进步,发展出更多、更有效的病原富集方法。