中国公共卫生  2010, Vol. 26 Issue (8): 1041-1042   PDF    
引用本文
李丹丹, 马焱, 曾祥洁, 陈海云, 潘正帆, 黄芳, 金玉明, 林春燕, 孙莲英. 海南省2008年手足口病样本核酸检测分析[J]. 中国公共卫生, 2010, 26(8): 1041-1042.
LI Dan-dan, MA Yan, ZENG Xiang-jie,et al. Viral nucleic acid detection with RT-PCR for specimens from hand-foot-mouth disease cases in Hainan province,2008[J]. Chinese Journal of Public Health, 2010, 26(8): 1041-1042.
海南省2008年手足口病样本核酸检测分析
李丹丹, 马焱, 曾祥洁, 陈海云, 潘正帆, 黄芳, 金玉明, 林春燕, 孙莲英    
海南省疾病预防控制中心微生物检验所, 海口570203
收稿日期: 2009-11-08.
基金项目: 海南省自然科学基金(309073)
作者简介: 李丹丹(1982- ),男,海南海口人,技师,本科,主要从事病毒性传染病的实验室诊断和研究工作。
通讯作者: 马焱
摘要: 目的 了解2008年海南省手足口病(HFMD)暴发的病原及主要的病毒型别,为HFMD病例诊断和防控措施提供科学依据。方法 依据卫生部《手足口病预防控制指南》提取HFMD临床诊断病例各种样本中的病毒核酸,用肠道病毒通用引物、肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CoxA16)特异性引物进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),检测基因片段大小。结果 274例临床诊断手足口病病例中EV71型核酸阳性、柯萨奇病毒A16核酸阳性、其他型别肠道病毒核酸阳性分别有102,12,35例;样本中疱疹液阳性检出率最高,为72.0%,肛拭子为40.0%,鼻咽拭子为34.8%,其余样本均阴性;54份直接提取病毒核酸进行RT-PCR检测,结果阴性但细胞培养出现细胞病理改变(CPE)的分离物;肠道病毒、EV71型、CoxA16型阳性分别有48,29,4份,阳性率分别为88.89%,53.70%,7.40%;其中1份样本EV71型和CoxAl6型均为阳性。结论 引起海南省2008年手足口病暴发流行的主要病原是肠道病毒71型,其次为CoxAl6型。
关键词: 手足口病     肠道病毒71型     柯萨奇病毒A16型     逆转录-聚合酶链式反应    
Viral nucleic acid detection with RT-PCR for specimens from hand-foot-mouth disease cases in Hainan province,2008
LI Dan-dan, MA Yan, ZENG Xiang-jie,et al    
Department of Microbiological Test, Hainan Provincial Center for Disease Control and Prevention, Haikou 570203, China
Abstract: Objective To reveal the pathogen of hand-foot-mouth disease(HFMD)and to know the main virus type in anoutbreak of HFMD in Hainan province in 2008.Methods According to the Hand-foot-mouth disease control and prevention guide(2008)issued by Health Ministry,the nucleic acids from specmiens such as nasal and throat swabs,anus swabs,herpes fluid of clinical diagnosed cases of HFMD were isolated.The RNA was amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)usingenterovirus universal prmie,renterovirus type 71 prmier and coxsackie virus group A type 16 prmier.Results Among 274 clinically diagnosed cases,EV 71 virus RNA was positive in 102 cases,CoxA16 virus RNA in 12 cases,and other entero virus RNA in 35 cases.The RNA testing positive rate of the herpes fluid was 72.0%,with a positive rate of 40% for anus swabs and 34.8% for nasal and throat swabs.The RNA of 54 specmiens detected directly by RT-PCR was negative.But these specmiens inoculated to RD cell line showed cytopathic effect and were identified by RT-PCR.The results showed that enterovirus RNA was positive in 48 specmiens(88.89%).EV 71 RNA was positive in 29 specmiens(53.7%);CoxA 16 RNA was positive in 4 specmiens(7.4%).Both EV 71 RNA and CoxA 16 RNA were positive in 1 specmien.Conclusion The major pathogen of HFMD was EV 71 causing the outbreak in Hainan province in 2008.CoxA 16 was one of the pathogens.The etiology surveillance of HFMD should bestreng thened in order to know the change of virus type and the trend of to xicity change.
Key words: hand-foot-mouth disease(HFMD)     enterovirus 71(EV 71)     coxasckie virus A16(CoxA 16)     reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)    

手足口病(HFMD)是婴幼儿常见的一种疾病,以手、足皮肤疱疹和口腔粘膜溃疡为主要临床特征,国内以肠道病毒71型(EV71)及柯萨奇病毒A组16型(CoxA l6)最为常见〔1〕。海南省2008年手足口病报告发病率为94.58/10万。由于肠道病毒传统的检测方法是病毒分离中和法定型,繁琐费时,不适合早期诊断,而逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)可快速准确检测出肠道病毒核酸,在HFMD病例诊断和病毒型别鉴定中具有较高的应用价值〔2, 3, 4〕。因此,本研究采用RT-PCR方法对其中274例疑似病例的样本进行检测。现将结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 样本

全省各市县报告的H FMD病例的鼻咽拭子、肛拭子、疱疹液、脑脊液、气管分泌物等。

1.2 主要试剂

病毒RNA提取试剂盒(QIAamp Viral RNA minikit德国QIAGEN公司)。肠道病毒、EV71以及CoxA16的阳性对照核酸(中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所,工作浓度为0 .1μg/μL),阴性对照为超纯水。RT-PCR反应体系成分: 5×缓冲液(Green Buffer)、MgCl2、dNTP (10 mmol/L)、逆转录酶 (10U/μL)、RNA酶抑制剂(Rnase Inhibitor,40 U/μL)、Taq DNA聚合酶(5 U/μL)(美国Promega公司)。DNA条带大小标记物 (DNA Marker,日本TaKaRa公司)。

1.3 PCR扩增引物

由中国疾病预防控制中心提供,引物序列及其扩增片段大小分别为:肠道病毒(EV)通用引物序列,上游:5'-TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C-3',下游: 5'-ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC-3',产物大小为116 bp;EV71特异性引物序列,上游:5'-GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC-3',下游5'-ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC-3',产物大小为226 bp;CoxA16特异性引物,上游:5'-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3',下游5'-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3 ',产物大小为208 bp。

1.4 方法

(1)样本采集与保存:按照卫生部发布的《手足口病预防控制指南》(2008年版)附件3“手足口病实验室检测方案”〔5〕操作。(2) RNA提取:参照QIAamp Viral RNAm in ikit试剂盒说明书进行,最终收集RNA提取液60μL。(3) RT -PCR及结果判定:RT-PCR按照文献〔5〕设置,每份体系总量为25μL。反应结束后,取RT-PCR产物5μL,用2%琼脂糖凝胶进行电泳,然后用核酸染料对其染色,将凝胶置于凝胶成像仪进行观察,根据琼脂糖凝胶上的条带大小判断结果。

2 结 果 2.1 手足口病病例RT-PCR检测结果(表 1,图 1)
表 1 海南省2008年274例HFMD病例样本RT-PCR检测结果

注: M: DNA M arker DL2000; 1 ~ 9: 手足口病例样本; 10: 阳性对 照; 11: 阴性对照。 图 1 部分病例RT-PCR 电泳结果

81例重症和193例一般病例中,肠道病毒通用引物、EV71特异性引物、CoxA16特异性引物的阳性检出率差异均无统计学意义。部分较好的病例样本RT-PCR电泳结果显示,3,5,6,7号为EV7 l型阳性;2号为CoxA16型阳性;8号样本EV71型和CoxA16型均阳性。

2.2 不同类型样本RT-PCR检测(表 2)
表 2 547份样本不同类型样本RT- PCR检测结果比较
2.3 经细胞培养出现CPE的分离物的病毒型别鉴定

54份 RT-PCR直接检测阴性但接种RD细胞后出现细胞病理改变 (CPE)的分离物进行RT-PCR检测,肠道病毒通用引物阳性率88 89%,EV71型引物阳性率53.70%,CoxA16型引物阳性率7.40%,其中有1份样本EV71型和CoxA16型引物均为阳性。

3 讨 论

本研究结果表明,疱疹液中肠道病毒核酸的阳性检出率最高,其次为肛拭子和咽拭子,提示在今后的样本采集时应尽量采集检出率较高的样本,以提高病原检出率。肠道病毒通用引物、EV71特异性引物和CoxA16特异性引物在重症和一般病例样本的病毒核酸检出率差异均无统计学意义,与部分地区多数重症病例和死亡病例为EV71感染的结果不同〔6, 7〕。可能与海南亚热带气候、人群既往肠道病毒感染状况、样本采集质量等因素有关。海南省2008年报告的HFMD病例中以农村人口居多,以< 5岁儿童为主,与当地的卫生条件差、居民缺乏良好的卫生习惯有关。引起海南省2008年HFMD流行的肠道病毒型别主要为EV71型,其次是CoxA16型,其他肠道病毒型别有待采用核酸序列测定等方法进一步鉴定。今后应加强手足口病的病原学监测,掌握病毒型别变化和毒力变异趋势,为手足口病的预防控制工作提供更加科学及时的实验室依据。

参考文献
〔1〕 杨秀惠,严延生.手足口病的病原学研究进展[J].传染病信息,2008,21(3):129-131.
〔2〕 严菊英,卢亦愚,徐昌平,等.肠道病毒EV 71荧光定量RT-PCR法快速检测[J].中国公共卫生,2009,25(7):843-844.
〔3〕 Yan JJ,Su IJ,Chen PF,et al. Complete genome analys is of enterovirus 71 isolated froman outbreak in Taiwan and rapididen tification of enterovirus 71 and coxsackie virus A16 by RT-PCR[J].J Med Virol, 2001,65:331-339.
〔4〕 王松,许诚,张红梅,等.RT-PCR检测手足口病病原体EV71[J/CD].中华实验和临床感染病杂志:电子版,2008,2(4):282-285.
〔5〕 中华人民共和国卫生部.手足口病预防控制指南[S].2008.
〔6〕 朱理业,丁振涛,万俊峰,等.阜阳市手足口病(EV 71感染)重症病例流行病学调查分析[J].安徽医学,2008,29(5):695.
〔7〕 吕华坤,缪梓萍,王笑笑,等.浙江省手足口病重症危险因素分析[J].疾病监测,2009,24(9):658-660.