原卟啉钠(protoporphyr in disodium,NAPP)是由4个吡咯环经4个次甲基键连接而成的含共轭双键的大环化合物,分子式为C₃₄H₃₂N₄Na₂O₄,可由动物血液中血红素提取制得。原卟啉钠是一种肝功能改善剂,有改善肝功能、促进组织细胞呼吸、改善蛋白质和糖代谢等作用^〔1〕。四氯化碳(CCl₄)在工业上用途广泛,主要经呼吸道和消化道进入体内,引起人和动物的肝脏损伤^{〔2, 3, 4〕}。本研究采用CCl₄小鼠急性肝损伤模型,通过检测小鼠肝组织过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力,探讨原卟啉钠保肝作用机制。现将结果报告如下。

ICR小鼠(浙江省实验动物中心)60只,4~ 6周龄,清洁级,体重(20±2)g,雌雄各半,合格证号:SCXK (浙)2008-0033。实验前适应性喂养7 d。

BS224S电子分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)感量0.0001g;U 2800紫外可见分光光度计(日本日立公司);台式高速冷冻离心机(美国Beckm an公司);原卟啉钠(本实验室自制);联苯双酯滴丸(浙江万邦药业有限公司,批号:081213);CCl₄(宿州化学试剂有限公司),分析纯;考马斯亮兰蛋白、CAT及GSH Px测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

将小鼠随机分为6组,即正常对照组、模型组、联苯双酯组(200 mg/kg)、原卟啉钠低 (30 mg/kg)、中(60 m g/kg)、高(120 m g/kg)剂量组,每组10只,联苯双酯组作为阳性对照^〔5〕。联苯双酯组、原卟啉钠低、中、高剂量组均按0.2 mL/10 g灌胃给药,正常对照和模型组灌胃给予等体积生理盐水,1次/d,连续10 d。末次给药后2 h,除正常对照组外,各组小鼠1次性腹腔注射0.3% CCl₄花生油溶液0.2 mL/10 g,建立急性肝损伤模型,正常对照组腹腔注射等体积花生油,禁食不禁水,于给药后16 h颈椎脱臼处死小鼠,剖腹,迅速取出肝脏备检。

取出肝脏,用 4%生理盐水洗去血污,滤纸拭干,计算肝脏指数。取肝大叶,约0.4~0.6 g,准确称重,加9倍4%生理盐水用玻璃匀浆器在冰水浴中匀浆10 min,制成10%肝匀浆,3 000 r/min、4%离心15 min,取上清测定肝组织匀浆中CAT和GSH-Px活力,具体操作按试剂盒说明书进行。

取小鼠肝脏次大肝叶保存于10%甲醛溶液中,送皖南医学院附属弋矶山医院病理科做组织切片,苏木素-伊红(HE)染色,光镜下观察各组小鼠肝脏组织病理学变化。

采用SPSS 15.0软件进行单因素方差分析,采用最小显著法(LSD)进行组间均数的两两比较,P < 0.05为差异有统计学意义。

表 1

表 1 原卟啉钠对CCI4 致肝损伤小鼠肝脏指数影响(x±s, n= 10)

表 1 原卟啉钠对CCI4 致肝损伤小鼠肝脏 指数影响(x±s, n= 10)

结果表明,各组小鼠体重差异无统计学意义(P > 0.05)。与正常对照组比较,模型组肝脏指数明显增加(P < 0.01);与模型组比较,联苯双酯组、原卟啉钠低、中、高剂量组肝脏指数降低,差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。

表 2

表 2 原卟啉钠对小鼠肝脏CAT和GSH-Px 活力影响(x±s, n= 10)

表 2 原卟啉钠对小鼠肝脏CAT和GSH-Px 活力影响(x±s, n= 10)

与正常对照组比较,模型组小鼠肝脏CAT、GSH-Px活力明显降低(P < 0.01);联苯双酯、原卟啉钠低、中、高剂量组肝脏CAT活力明显升高,差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01);联苯双酯和原卟啉钠高剂量组肝脏GSH-Px活力明显高于模型组,差异有统计学意义(P < 0.05)。

正常对照组小鼠肝脏外观呈红褐色,质地柔软且有弹性。模型组小鼠肝脏体积增大,淤血明显,表面有大量点状出血。原卟啉钠低剂量组肝脏轻度肿大,点状出血明显减少,而中、高剂量组肝脏外观基本正常。镜下观察见正常对照组小鼠肝小叶结构完整。模型组小鼠肝小叶结构被破坏,肝窦及中央静脉明显扩张、充血,肝索排列紊乱,可见明显的桥接坏死,肝小叶及汇管区有大量炎细胞浸润;联苯双酯、原卟啉钠低剂量组以肝细胞水样变性为主,炎细胞浸润有减少;原卟啉钠中、高剂量组肝小叶破坏程度和肝细胞水肿变性明显减轻,坏死减少,肝小叶结构清楚,肝细胞排列较整齐,肝组织炎症明显改善。

CCl₄肝损伤模型是目前研究保肝药物作用及机制最常用的病理模型,CCl₄进入机体后,破坏细胞膜的结构和完整性,干扰细胞蛋白的合成,引起细胞中毒死亡^{〔6, 7〕}。CAT、 GSH-Px是体内主要的抗氧化酶,激活或调动机体内源性抗氧化系统,预防或减轻自由基损伤,防止脂质过氧化^〔8〕。通过对机体CAT、GSH-Px活力的检测,可以确定组织脂质过氧化的程度^〔9〕。

本研究中,经CCl₄处理后模型组小鼠肝脏指数明显增大 (P < 0.01),病理切片示肝细胞受损严重,表明模型复制成功。原卟啉钠各剂量组小鼠的肝脏指数明显降低(P < 0.05或P < 0.01),肝组织炎症病变明显减轻,呈剂量依赖性,提示原卟啉钠对缓解肝脏肿大具有一定作用,能明显减轻CCl₄对肝脏的病理损伤。CCl₄模型组肝脏CAT和GSH-Px活力明显降低(P < 0.01),原卟啉钠各剂量组较模型组CAT和GSH-Px活力明显升高(P < 0.05或P < 0.01),表明原卟啉钠可通过阻止肝脏抗氧化酶CAT和GSH-Px活性降低增强机体清除自由基能力,抑制脂质过氧化链式反应的启动,减轻CCl₄对小鼠造成的急性肝损伤。其机制可能与CAT、GSH-Px等很多酶是以卟啉为辅基有关,体外给予原卟啉钠,可促使细胞内卟啉和金属卟啉的生物合成增加,从而阻止体内抗氧化酶活性降低。