中国公共卫生  2010, Vol. 26 Issue (8): 1017-1019   PDF    
引用本文
徐振平, 王聪睿, 张艳芬, 吴红龙, 张光谋, 郭志坤. 心肌肥厚大鼠心肌细胞变化与Cx43表达[J]. 中国公共卫生, 2010, 26(8): 1017-1019.
XU Zhen-ping, WANG Cong-rui, ZHANG Yan-fen,et al. Expression of connexin 43 and pathological changs of cardiomyocyte in myocardial hypertrophy rats[J]. Chinese Journal of Public Health, 2010, 26(8): 1017-1019.
心肌肥厚大鼠心肌细胞变化与Cx43表达
徐振平, 王聪睿, 张艳芬, 吴红龙, 张光谋, 郭志坤    
新乡医学院生命科学技术系遗传与基因工程教研室, 河南新乡453003
收稿日期: 2009-08-28.
基金项目: 河南省教育厅青年骨干教师资助项目(182)
作者简介: 徐振平(1963- ),女,河南卫辉人,教授,硕士,主要从事细胞生物学及遗传学方面的研究。
摘要: 目的 探讨异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)致心肌肥厚大鼠心肌细胞间隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)表达的变化。方法 皮下注射,异丙肾上腺素4 mg/(kg·d),每日2次,连续5 d,建立大鼠心肌肥厚模型(ISO组),观察大鼠体重(mB)、心脏重量(mH)和左心室重量(mLV),心肌细胞横径(transdiameter of cardiomyocyte,TDM)和心肌细胞截面积(cardiomyocyte area,CA),苏木素伊红(HE)染色观察细胞病理学改变,免疫组化染色和蛋白印记(western blotting)方法观察心肌细胞Cx43的变化。结果 与对照组比较,ISO组大鼠mH/mB、mLV/mB、TDM和CA明显增加(P<0.05,P<0.01);心肌细胞病理学显示,ISO组心肌纤维走向紊乱,细胞大小不均,较对照组心肌细胞变大,密度变小;免疫组化结果表明,对照组大鼠心肌细胞Cx43颗粒典型地排列在心肌闰盘处,ISO组心肌细胞Cx43颗粒发生重排,杂乱分布于闰盘、心肌细胞膜各部位和胞浆内;蛋白印记法结果显示,ISO组Cx43表达量明显低于对照组。结论 异丙肾上腺素致心肌肥厚导致Cx43蛋白表达改变,加速间隙连接降解和功能异常。
关键词: 异丙肾上腺素     心肌肥厚     心肌细胞     间隙连接蛋白43(Cx43)     大鼠    
Expression of connexin 43 and pathological changs of cardiomyocyte in myocardial hypertrophy rats
XU Zhen-ping, WANG Cong-rui, ZHANG Yan-fen,et al    
Department of Genetics and Gene Engineering, Branch of Life Science and Technique, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China
Abstract: Objective To study the expression of connex in 43 g apjunction prote in of cardiomyocytes in ventricular hypertrophy rats induced by isoprote renol(ISO).Methods Myocardial hypertrophy model of rat was induced by injection of ISO 4 mg(1kg·d),two times a day for 5 days.Body,heart,and left ventricular mass of the rats were weighted.Transdiameter of cardiomyocyte(TDM)and cardiomyocyte area(CA)were measured under microscope.Pathological changes in cardiomyocytes with HE staining were observed.The expression of connex in 43 in cardiomyocytes wasmeasured using mimunocy tochemistry and western bloting.Results Compared with the control group,the ratio of heart mass/body mas,sleft ventricular mass/body mass,TDM,and CA increased markedly(P<0.05,P<0.01).The direction of myocardial fiber was diso rdered in ISO group.The cell size was unequal and cell density became lower than that of the control group.Immunola beling of connexin 43 was confined to the intercalated disks in the normal ventricular myocytes of control rats.But hypertro phied cardiomyocytes of ISO rats showed dispersion of connex in 43 mimunolabelled over the cell surface and in the cytoplasm.The result of western bloting showed decreased expression of connexin 43 in ISO group.Conclusion Myocardial hypertrophy induced by ISO is associated with the expression of connex in 43 and ISO accelerates gapjunction degradation.
Key words: isoproterenol     myocardial hypertrophy     cardiomyocyte     connex in 43     rat    

心肌肥厚是心脏功能从代偿期向失代偿期演变及心脏结构从可逆向不可逆发展的关键阶段,是导致心血管疾病发生及死亡率升高的独立危险因素〔1〕。研究表明,心脏功能的这种改变与间隙连接蛋白43(Cx43)〔2〕密切相关,负荷诱导心肌肥厚可导致心肌细胞Cx43的表达下调〔3〕,肺动脉高压大鼠右心室肥厚与Cx43重新分布及其脱磷酸化有关〔4, 5〕,Cx43表达改变与心梗和心肌缺血等疾病有关〔6, 7〕。为了观察心肌肥厚时心肌细胞的改变以及C x43蛋白表达变化,探讨心肌肥厚的发生机制,本研究采用异丙肾上腺素(ISO)诱导,建立大鼠心肌肥厚模型,检测其心脏、心室重量,观察心肌细胞横径与截面积、病理学改变及Cx43蛋白表达水平。现将结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料

(1)实验动物与模型制备:健康成年SD大鼠(新乡医学院实验动物中心)20只,雌雄不限。随机平均分为2组。参照文献〔8〕制备大鼠ISO模型,背部皮下注射异丙肾上腺素4 mg/(kg•d);对照组注射生理盐水2 ml/(kg•d);2组均每日注射2次,连续5 d;给药结束后观察48 h,称量体重 (mB)。(2)主要试剂:兔抗Cx43多克隆抗体(美国zymed公司);SP试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司);聚偏二氟乙烯膜(polyviny lidene fluoride,PVDF膜)(美国PALL公司),氯化硝基四氮唑蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐法检测试剂盒(美国Sigma公司)。

1.2 方法 1.2.1 心脏、心室质量指数检测

观察期满称取体重后,采用10%氨基甲酸乙酯溶液(10 mL/kg)腹腔注射麻醉,开胸取心脏,称量心脏重量(mH),左心室重量(mLV)(含室间隔),计算心脏重量指数mH/mB和心室重量指数mLV/mB。

1.2.2 心肌标本制备

沿左心室最宽处垂直于长轴,将其分成两部分,切取左心室心肌含室间隔标本2块,标记后1块置于4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,连续切片,片厚5μm,进行形态学和免疫组织化学观察;另1块置于液氮中保存供蛋白印迹试验(Western blotting)制备匀浆用。

1.2.3 TDM与CA检测

心肌标本切片经苏木素伊红染色,显微镜下观察病理改变;同时在400倍视野下,每组随机取5个视野,每个视野选择细胞边界清楚且细胞核位于细胞中央的20个心肌细胞,测量心肌细胞横径(TDM)和心肌细胞截面积(CA),计算平均值。

1.2.4 免疫组织化学染色

采用免疫组织化学染色法检测心肌细胞Cx43表达颗粒;一抗采用兔抗Cx43多克隆抗体,按1:300稀释,严格按照过氧化酶(SP)试剂盒说明书操作,二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素伊红复染;以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照;Cx43表达以细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性。

1.2.5 心肌细胞Cx43检测

Western blotting法检测心肌细胞Cx43表达,严格按照试剂盒说明书操作。

1.3 统计分析

采用SSPS 10.0软件进行统计分析,组间差异比较采用t检验,P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 心肌肥厚模型大鼠心脏、心室质量比及心肌横径和截面积变化(表 1)
表 1 心肌肥厚大鼠心室质量指数、TDM及CA 的改变(x±s)

与对照组比较,模型组大鼠心脏重量指数、心室重量指数、TDM和CA均明显增加,差异有统计学意义。

2.2 心肌细胞病理学改变(图 1)
图 1 心肌肥厚大鼠左心室肌细胞(HE染色, 200×)

对照组心肌细胞染色均匀,心肌纤维排列整齐,横纹清楚;模型组心肌细胞染色不均,心肌纤维走向紊乱,细胞大小不均,心肌细胞直径明显变大,细胞密度变小,毛细血管密度减少,细胞间质增多,细胞间距变大,有大量纤维细胞填入,将心肌细胞撕裂开来。

2.3 心肌细胞Cx43蛋白表达颗粒(图 2)
图 2 心肌肥厚大鼠左心室肌细胞Cx43表达(免疫组化染色、苏木素- 复染, 400×)

Cx43蛋白主要分布在心肌细胞膜上。对照组心肌细胞Cx43棕色阳性颗粒呈斑点或带状,其排列有高度的规律性。在心肌纤维的纵切面上,Cx43呈链状分布在与心肌纤维长轴垂直的细胞端-端相接的闰盘部位,极少数位于与心肌纤维长轴平行的细胞侧-侧相接的部位;ISO组心肌细胞Cx43阳性颗粒则发生重排,多数依然存在于细胞端-端相接处,但部分颗粒已经开始从闰盘处向四周扩散,分布紊乱,出现在整个细胞膜表面各个部位以及细胞胞浆内,甚至表现为不同区域的增多或减少。

2.4 心肌细胞Cx43表达量(图 3)
图 3 心肌肥厚大鼠心肌细胞Cx43蛋白表达

与对照组比较,模型组大鼠心肌细胞中Cx43蛋白表达水平明显降低。

3 讨 论

本研究结果显示,异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌肥厚模型,心重比明显高于对照组,心肌细胞横径截面积明显增加,心肌细胞染色不均,心肌纤维走向紊乱,细胞大小不均,表明异丙肾上腺素诱导心肌肥厚模型非常成功。

检测结果表明,心肌肥厚大鼠的心肌细胞Cx43蛋白染色颗粒的分布明显改变,细胞端闰盘处Cx43部分消失,移位至细胞膜各个部位及细胞质中,使心肌电冲动传导速度的不均一性增高,导致心脏收缩功能异常〔9, 10, 11〕。Western blotting结果显示,Cx43的表达量在肥大心肌细胞中减少,提示心肌肥大时〔3〕,Cx43蛋白含量及分布均已发生明显改变。推测在心肌肥厚时心肌端闰盘可能是最先出现细胞间失耦联的地方,同时Cx43在心肌细胞由端闰盘向纵轴的重新分布,使细胞间纵向阻抗增加,冲动传导速度减慢;而Cx43在细胞表面的无序分布则可能造成非均匀性电脱耦联,致单向阻滞区形成。这2种变化均可能由于心室重构等过程中,各种心肌细胞间隙连接蛋白之间存在复杂的协同、代偿调节机制。

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