中国公共卫生  2010, Vol. 26 Issue (8): 989-990   PDF    
引用本文
符丰华, 沈阿丹, 黄小舟, 李勃兴, 黄潋滟. HIF-1参与KATP通道对神经元缺氧损伤保护作用[J]. 中国公共卫生, 2010, 26(8): 989-990.
FU Feng-hua, SHEN A-dan, HUANG Xiao-zhou,et al. Protective effect of HIF-1 mediates ATP-sensitive K+ channel on hippocampal neurons with chronic hypoxia[J]. Chinese Journal of Public Health, 2010, 26(8): 989-990.
HIF-1参与KATP通道对神经元缺氧损伤保护作用
符丰华1, 沈阿丹2, 黄小舟3, 李勃兴4, 黄潋滟4    
1. 广州军区机关门诊部保健科, 广东510515;
2. 广州军区广州总医院;
3. 中山大学第三附属医院;
4. 南方医科大学公共卫生与热带医学学院
收稿日期: 2010-02-15.
基金项目: 国家自然科学基金(30900581)
作者简介: 符丰华(1980- ),男,海南东方人,主治医师,本科,主要从事脑卒中研究。
通讯作者: 黄潋滟
摘要: 目的 探讨三磷酸腺苷(ATP)敏感性钾通道(KATP通道)在缺氧中对海马神经元的保护作用机制。方法 比较对照组、单纯缺氧组、KATP通道激动剂+缺氧组、KATP通道阻断剂+缺氧组中神经元缺氧诱导因子1α亚基(HIF-1α)的蛋白表达、DNA断裂、以及神经元存活情况。结果 试验持续8,12,24 h后,正常氧分压组细胞存活率为(100±0.98)%,缺氧8,12,24 h后,细胞的存活率分别降至(85.76±3.31)%,(80.13±1.76)%,(72.24±3.87)%,差异均有统计学意义(P<0.05);缺氧12,24 h后,缺氧+二氮嗪组细胞凋亡率分别为(8.1±3.1)%,(18.4±2.3)%,缺氧+甲糖宁组分别为(32.5±1.6)%,(45.7±3.4)%,与单纯缺氧组的(20.3±2.2)%,(31.6±1.7)%比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 KATP通道可以通过上调HIF-1α的蛋白表达水平,对缺氧中的海马神经元起到保护作用。
关键词: ATP敏感性钾通道     重度缺氧     海马神经元     缺氧诱导因子    
Protective effect of HIF-1 mediates ATP-sensitive K+ channel on hippocampal neurons with chronic hypoxia
FU Feng-hua, SHEN A-dan, HUANG Xiao-zhou,et al    
Department of Health Care, Outpatient Department, Institution of Health Care Guangzhou Military District, Guangzhou 510515, China
Abstract: Objective To study the mechan ism s o f KATP channels protection on hippo campal neurons aga instapoptosis induced by chronic severe hypoxia.Methods The hypoxia inducible factor-1α(HIF-1α)expre ssion,DNA fraction,and cell apoptosis in control group,hypoxia group,hypoxia group treated with KATP channels antagonist and hypoxia group treated with KATP channels agonist were examined.Results After a 12 hours exposure to oxygen concentration of 0%,diazoxide (100 M),and KATP channels agonist,HIF-1α expression was increased and the hypoxic induced apoptosis was reduced.In contrast,to lbutamide(100 M),the KATP channels antagon istblocking the cellular sulphony lureas receptor,significantly rose the hypoxic induced apoptosis but down regulated HIF-1α expression.Conclusion KATP channels protect hippo campal neurons against chronic severe hypoxiavia down regulation of HIF-1α.
Key words: KATP channels     severe hypoxia     hippocampal neuron     hypoxia inducible factor    

脑卒中是中国第二大死亡原因和首位致残原因,是以缺血缺氧性脑神经元死亡为病理特征的一类疾病,但目前临床治疗上缺乏有效的治疗手段。三磷酸腺苷(ATP)敏感性钾通道(KATP通道)参与多种细胞功能调控,同时也涉及神经元再生及死亡等过程〔1, 2, 3〕。有研究表明,在缺氧的情况下,KATP通道的激活对缺氧中的神经元具有明显保护作用〔4〕,但其机制不明。缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducib lefactor,HIF-1)是机体缺氧刺激诱导产生的特异性转录因子,其激活相关基因的表达,以适应缺氧的环境〔5〕。本研究通过离体培养海马神经元缺氧模型,探讨KATP通道的开放对缺氧神经元的保护作用是否通过调节HIF-1 表达变化实现,为脑卒中等疾病的临床治疗提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 试剂与仪器

DMEM高糖培养液干粉(美国GIBCO公司);甲糖宁、二氮嗪、Hoechst 33342染色液、10 mg/L多聚赖氨酸(美国Sigma公司);血清(杭州四季青公司);Trizol试剂 (美国Invitrogen公司);一步法RNA PCR试剂盒(日本Takara公司);HIF-1 多克隆抗体(美国SantaCruz公司);β-actin多克隆抗体(武汉博士德公司)。MODEL818 CO2细胞培养箱(美国NAPCO公司);酶标仪(台湾ERMA公司);BH2-RFL-T3荧光显微镜、IX700倒置显微镜(日本Olympus公司);低温高速离心机、DU-530核酸蛋白分析仪(美国Beckman公司);DocG el2000凝胶扫描成像系统、电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 实验动物

出生24 h以内的SD新生大鼠100只(南方医科大学实验动物中心,许可证号:SCXK粤200620015),雌雄各半。

1.3 细胞培养与分组

取出生24 h以内的SD大鼠,无菌条件下分离出海马,0 125%胰酶消化、分散并制成1×106/mL密度的细胞悬液,接种于包被有多聚赖氨酸的35 mm塑料培养皿或96孔板中(2 mL/皿或100μL/孔),置于37%、含5% CO2的培养箱培养。接种后第3 d,加入细胞分裂抑制剂阿糖胞苷4μg/mL以抑制非神经细胞的过度增殖,作用48 h后更换新鲜培养液。之后每3 d换液1次,每次更换50%新鲜培养液。培养1周后,将细胞分为4组:第1组为正常氧分压组,在正常氧状态中(5% CO2、95%空气)孵育;另外3组分别为单纯缺氧组、缺氧+二氮嗪组、缺氧+甲糖宁组,均在(5% CO2、95% N2)模拟的慢性重度缺氧状态孵育〔6, 7〕,缺氧时间持续8,12,24 h。缺氧+二氮嗪组、缺氧+甲糖宁组在缺氧同时分别给予KATP通道的激动剂二氮嗪(100μmol/L)和阻断剂甲糖宁(100μmol/L)。

1.4 神经元凋亡检测 1)四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色法:在培养液中加入MTT (20μL/孔),置5% CO2,37%培养箱内培养3~4 h,去除培养液,加入二甲基亚砜(DM SO)震荡混匀后,酶标仪测定570 nm波长的吸光度〔8〕,比较正常氧分压组与单纯缺氧组缺氧持续8,12,24 h后的细胞存活率。(2) Hoechst染色:将Hoechst 33342染色液加入培养的细胞中,终浓度为10μg/mL,37%避光孵育1 h。荧光显微镜观察凋亡神经细胞形态。比较缺氧12和24 h后各组细胞凋亡情况。

1.5 免疫印记〔9〕

采用免疫印迹方法检测试验持续12 h后各组HIF-1蛋白表达水平。将收集的神经元裂解,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳后将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜 (PVDF膜)。转移结束后,取出PVDF膜,依次置于5%脱脂奶粉、磷酸盐缓冲液、一抗、二抗中孵育,使用化学发光法暗室显影,使用Alpha凝胶成像系统采集信号,使用Fluo rChem软件进行光密度分析。

1.6 统计分析

采用SPSS 10.0软件进行单因素方差分析和最小显著差法(LSD法)检验。

2 结 果 2.1 缺氧诱导海马神经元凋亡

将培养7 d的海马神经元暴露于缺氧环境中,缺氧后不同时间显微镜下观察,发现随缺氧时间延长,缺氧组出现胞体肿胀或皱缩、突起回缩或消失、胞核凝聚的神经元比例增加。MTT结果表明,正常氧分压组细胞存活率为(100±0.98)%,缺氧8,12,24 h后,细胞的存活率分别降至(85.76±3.31)%,(80.13±1.76)%,(72.24 ±3.87)%,差异均有统计学意义(P < 0.05)。

2.2 各组不同时间点神经元凋亡率(表 1)
表 1 不同时间点各组神经元凋亡率(%)

处理缺氧+二氮嗪组和缺氧+甲糖宁组12,24 h后的神经凋亡率与单纯缺氧组比较,差异均有统计学意义(P < 0.05)。

2.3 处理12h后各组HIF-1 蛋白表达情况

单纯缺氧组 HIF-1 蛋白表达较正常氧分压组明显升高(P < 0.05)。与单纯缺氧组比较,缺氧+甲糖宁组HIF-1 的蛋白表达水平明显降低(P < 0.05),而缺氧+二氮嗪组HIF-1 的蛋白表达水平明显升高(P < 0.05)。

注: 1: 正常氧分压组; 2: 单纯缺氧组; 3: 缺氧+ 二氮嗪组;
4: 缺氧+ 甲糖宁组。 图 1 处理12 h后各组HIF-1α 蛋白表达情况
3 讨 论

有研究表明,在缺氧情况下,KATP通道的激活对缺氧中的神经元具有明显保护作用〔4〕,其作用机制尚不清楚。本研究结果表明:在缺氧条件下,KATP通道的开放剂二氮嗪能够增加HIF-1 的蛋白表达并减少神经元凋亡,而KATP通道阻断剂甲糖宁则降低HIF-1 的蛋白表达并促进神经元凋亡,与文献〔9, 10〕结果一致,而且提出了KATP通道保护细胞新的可能机制,即促进HIF-1 的蛋白表达。HIF-1可结合缺氧反应元件(HRE)中的特定序列,促使其下游具有神经保护作用的靶基因如血管内皮生长因子(VEGF)等转录增加〔11, 12〕,从而使组织和细胞适应低氧环境〔13〕。

KATP通道对HIF-1的调节作用依赖于其对钾离子的通透作用,但具体的下游信号转导通路还有待进一步研究。一种可能的机制是,当KATP通道激活时,外流的钾离子影响细胞内钙离子的浓度,从而激活钙依赖性的信号转导机制,进而影响HIF-1的表达。同时,KATP通道的激动剂及阻断剂也可能改变通道的构象,并进而影响与KATP通道相互结合的蛋白质而改变下游的信号转导通路,从而影响HIF-1的表达。

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