中国公共卫生  2010, Vol. 26 Issue (8): 987-988   PDF    
引用本文
戴佳琳, 黄江, 李波, 廖兴江, 王宇. 牛带绦虫乳酸脱氢酶基因原核表达及免疫学特征[J]. 中国公共卫生, 2010, 26(8): 987-988.
DAI Jia-lin, HUANG Jiang, LI Bo,et al. Prokaryotic expression of lactate dehydrogenase from Teania saginata and its immunological identification[J]. Chinese Journal of Public Health, 2010, 26(8): 987-988.
牛带绦虫乳酸脱氢酶基因原核表达及免疫学特征
戴佳琳1, 黄江2, 李波2, 廖兴江2, 王宇2    
1. 贵阳医学院多媒体形态学实验室, 贵州贵阳550004;
2. 贵阳医学院人体寄生虫教研室
收稿日期: 2010-04-29.
基金项目: 国家自然科学基金(30760227);贵州省科技攻关项目(2008-3060);贵州省科技攻关项目(2009-3101);贵州省农业科技攻关项目〔黔科合NY字(2009-3074)〕;贵州省省长基金〔黔省专合字(2009)82号〕;贵阳市科技局社发攻关项目(2009-3005)
作者简介: 戴佳琳(1977- ),女,布依族,讲师,硕士,主要从事法医物证及病原生物学分子水平研究。
通讯作者: 黄江
摘要: 目的 克隆牛带绦虫乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)基因在大肠杆菌中表达,研究其免疫学特征。方法 将牛带绦虫成虫LDH基因与质粒pET-28a(+)连接构建原核重组质粒,在大肠埃希菌BL21/DE3中用异丙硫代-β-D半乳糖苷诱导表达,表达产物通过十二烷基-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Westernblotting)进行分析。结果 牛带绦虫乳酸脱氢酶基因编码332个氨基酸,理论分子量为35.4kDa,PCR、双酶切及DNA测序的结果均证明pET-28a(+)-LDH构建成功;SDS-PAGE结果表明,牛带LDH基因在大肠埃希菌高效表达,经过亲和层析高纯度蛋白,且该重组蛋白可以被亚洲带绦虫、牛带绦虫及猪带绦虫感染病人血清识别,表明其具有免疫反应性。结论 牛带绦虫LDH基因可在原核系统中有免疫活性的高效表达。
关键词: 牛带绦虫     乳酸脱氢酶     原核表达     免疫活性    
Prokaryotic expression of lactate dehydrogenase from Teania saginata and its immunological identification
DAI Jia-lin, HUANG Jiang,LI Bo,et al    
Department of Forensic Medicine, Guiyang Medical College, Guiyang 550004, China
Abstract: Objective To clone and express the geneencoding lactate dehydrogenase(LDH)protein from Teania saginata and to studyits mimunological characters.Methods The gene was cloned into prokaryotic expression vector pET-28a(+)and then transformed to E.coli BL21 with IPTG induction.There after,the gene product was analyzed by SDS-PAGE and western blotting and purified by NiN-TA affinity chroma to graphy.Results The gene encodes 332 aminoacids with a theoretical molecular weight of 35.4kDa.As demonstrated by PCR,double enzymedigestion and DNA sequencing,there combinant plasmid pET-28(+)LDH was constructed successfully,and high expression of E.coli BL21 was obtained as demonstrated by SDS-PAGE assay.The recom binant prote in could be recognized by serum of patients with Taenia asiatica and Taeniarhynchus saginatus infection,indicating its mimunoreactivity.Conclusion Highly purified preparation of the protein with definite immunoreactivity was obtained through purification with affinity.
Key words: Taenia saginatal     ctate dehydrogenase     prokaryotic expression     mimunologic activity    

带绦虫病是中国西部地区常见的人畜共患病,严重影响西部地区的经济发展。本课题组长期致力于3种人体带绦虫功能基因对比研究,从进化、代谢、生殖等各方面找到3种带绦虫相同或相异的特征,为预防和治疗带绦虫病提供理论基础。前期,本课题组已经对亚洲带绦虫及猪带绦虫的乳酸脱氢酶基因成功的构建了原核表达质粒和进行了相关免疫分析〔1, 2, 3〕,因此,本次实验从牛带绦虫成虫cDNA质粒文库筛选出乳酸脱氢酶同源基因并进行研究,为该基因的表达和调控提供依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 感染血清、文库、质粒和菌株

牛带绦虫成虫cDNA质粒文库本室与上海联合基因有限公司合作;原核表达质粒 pET-28a (+)及大肠埃希菌BL-21/DE3(中山大学热带病防治教育部重点实验室)。亚洲带绦虫病人、猪带绦虫病人及牛带绦虫病人血清取自粪检阳性的带绦虫患者。

1.1.2 主要试剂和工具酶

ExTaq酶(含dNTP),BamH1,XhoI,T4 DNA连接酶,DNA标准(DL15,000;DL2,000)(大连宝生物工程公司);异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)(美国Promega公司);NiIDA Agarose (cat No:69670)(美国Novagen公司);蛋白分子量标准(立陶宛MBI公司);DNA凝胶回收试剂盒(上海铂尔生物科技公司);质粒纯化试剂盒(广州东盛科技公司);辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG二抗,兔抗人二抗,3,3二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);丙烯酰胺、尿素(美国MBCHEM公司);氯化钙、氯化钠等试剂(国产分析纯)。

1.1.3 引物合成和DNA测序

牛带绦虫乳酸脱氢酶(LDH)基因扩增引物(中国英伟创津公司);重组体测序(北京华大基因公司)。

1.2 方法 1.2.1 牛带绦虫LDH基因的识别

利用美国国家生物枝术信息中心(NCBI)的Blastx对Unigene进行对比识别〔4〕,分析基因编码序列的完整性,采用在线生物信息学软件对推导的氨基酸序列进行蛋白质结构和功能的预测分析。

1.2.2 牛带绦虫LDH基因的扩增

根据已获得基因的全长编码区序列设计引物。上游引物:TTAGAATTCATGCATGGTGGAGGTTTG,引入EcoRI酶切位点;下游引物:AATCTGGAGTCACCACTTGATGTCTG,引入XholI酶切位点。以文库中编号质粒为模板进行聚合酶链反应(polymerase chain reactiom,PCR)扩增目的基因。PCR产物用1.0 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定回收。

1.2.3 重组体的构建及诱导表达

PCR产物和pET 28a (+)载体分别用E coRI和XholI双酶切,回收、连接后转入大肠埃希菌BL21/DE3感受态细胞,卡拉霉素筛选阳性克隆,对阳性克隆依次进行质粒的提取,双酶切和PCR鉴定。取培养过夜的阳性克隆菌液加入培养基(Kana+),37℃250r/min振摇至菌液A600=0.4~0.6,加入IPTG至终浓度1 mmol/L诱导5 h。同时分别制备小量诱导体积和不加IPTG诱导的菌液各5mL。

1.2.4 牛带绦虫LDH的纯化

收集菌液,于4℃4 500 r/ min离心5 min,3次冻融后用基础液重悬沉淀,再行超声破碎。收集上清和沉淀行十二烷基一聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)判断重组蛋白的可溶性。将样品加入预先处理好的Ni IDA His.Bind树脂亲和层析纯化柱中,最后再用磷酸盐缓冲液(PBS)透析。

1.2.5 重组表达产物蛋白印迹(Western blotting)鉴定

将表达产物按上述方法行SDS PAGE电泳,使用电转移方法将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。室温封闭2h后与亚带、牛带、猪带绦虫病人及正常人血清(按1: 400稀释)结合,4℃孵育过夜;次日,(PBS)洗3次,然后与辣根过氧化物酶 (HRP)标记的兔抗人IgG (按1:2000稀释)室温孵育1 h,PBS洗3次;最后DAB显色至出现目的条带,超纯水终止反应。

2 结 果 2.1 LDH基因的识别和序列分析

经分析,牛带绦虫LDH为全长基因,具有完整阅读框。含有996个碱基,编码332个氨基酸,理论分子量为35.4 kDa,该基因序列与华支睾吸虫的基因序列一致性为54%,同源性为72%。二级结构显示有3个跨膜区。

2.2 原核重组质粒的鉴定(图 1)
注: M1: DNA标准( DL2000 ) ; 1: PCR 产物; 2: pET-28a( + )-LDH 重组
质粒; 3: pET-28a( + )-LDH 质粒双酶切; M2: DNA 标准( DL 15000)。 图 1 重组质粒的PCR和双酶切鉴定

将重组质粒进行PCR和双酶切鉴定,产物行1.0 g/L琼脂糖凝胶电泳。结果显示在 600bp左右有一清晰条带,与目的基因大小基本相符,此外,DNA测序结果也表明重组质粒构建成功。

2.3 蛋白表达纯化结果(图 2)
注: M: 蛋白M ark er; 1. pET-28a( + )未诱; 2: pET-28 a( + )诱导;
3: pET-28 a( + )-LDH 未诱; 4: pET-28 a( + )-LDH 诱导;
4: pET-28 a( + )-LDH 上清; 6: pET-28 a( + )-LDH 纯化蛋白。 图 2 SD S-PAGE分析pET-28a(+)-LDH在大肠

将构建好的重组质粒转化到E.coli BL/DE3中表达,超声裂解后SDS PAGE电泳分析在大约36 kDa处出现高效表达条带,与目的蛋白基本相符。将蛋白进行纯化,结果如图中第6泳道所示,其位置与目的蛋白相符,证明目的蛋白纯化成功。

2.4 纯化蛋白免疫反应性(Western blotting鉴定)

用感染亚洲带绦虫、猪带绦虫的患者血清以及感染牛带绦虫的患者血清对纯化蛋白的Western blotting结果均显示出较清晰的条带,而阴性对照血清在相应位置未识别出该蛋白条带。

3 讨 论

本实验通过合理的克隆策略,成功的构建了重组质粒。将融合表达和纯化的产物行SDS-PAGE电泳分析,结果显示目的条带分子量与预测值基本一致,表明重组蛋白得到了表达并纯化成功。Western blotting结果显示重组蛋白能被猪带、亚带及牛带绦虫病人血清识别,表明重组蛋白能够与患者血清中的特异抗体反应,具有免疫反应性。研究显示牛带绦虫LDH可以获得具有免疫活性的高效表达,说明牛带绦虫 LDH是牛带绦虫的一个抗原分子,也是一个具有开发潜力的基因。

脱氢酶类是生物体内氧化还原反应中重要的催化剂之一,在生物体内的氧化产能、解毒及某些生理活动中起重要的作用。乳酸脱氢酶主要存在于动物的肌肉中,不仅对于物种遗传和进化有意义,还可以在动物或寄生虫个体发育过程中提供良好的研究模式。已经证实,血吸虫和华支睾吸虫LDH分子是一个潜在的诊断和疫苗候选分子,又是很多抗寄生虫药物的作用靶点之一。所以,将3种人体带绦虫LDH的功能进行对比研究对于带绦虫的预防、诊断和治疗具有重要的意义。

参考文献
〔1〕 戴鹏,戴佳琳,黄江,等.亚洲牛带绦虫T aCRISP基因克隆,表达和序列分析[J].中国公共卫生,2009,25(4):398.
〔2〕 廖兴江,戴佳琳,黄江,等.亚洲牛带绦虫NONO I基因在原核细胞中表达[J].中国公共卫生,2009,25(5):555.
〔3〕 杜武英,黄江,胡旭初,等.猪带绦虫乳酸脱氢酶基因的序列分析、克隆表达和免疫学分析[J].中国人兽共患病学报,2010,26(3):246-251.
〔4〕 BoguskiMS,Bio informatics[J].Cur Opin Genet Dev,1994,4(3):383-388.