中国公共卫生  2010, Vol. 26 Issue (8): 956-957   PDF    
引用本文
司道文, 孟景山, 张廷才, 张宇新, 张子明. 孕酮对大鼠创伤性脑损伤保护作用[J]. 中国公共卫生, 2010, 26(8): 956-957.
SI Dao-wen, MENG Jing-shan, ZHANG Ting-cai,et al. Neuroprotective effect and its mechanism of progesterone on neurons after traumatic brain injury in rats[J]. Chinese Journal of Public Health, 2010, 26(8): 956-957.
孕酮对大鼠创伤性脑损伤保护作用
司道文, 孟景山, 张廷才, 张宇新, 张子明    
华北煤炭医学院解剖学教研室, 河北唐山063000
收稿日期: 2009-12-04.
基金项目: 唐山市科学技术研究与发展计划资助项目(08130224C)
作者简介: 司道文(1975- ),男,黑龙江双城人,讲师,硕士,研究方向:中枢神经系统损伤与修复。
摘要: 目的 探讨孕酮(progesterone,PROG)对大鼠创伤性脑损伤(TBI)后皮质诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和凋亡蛋白酶(caspase-3)表达影响。方法 将健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、脑损伤组、孕酮治疗组。按照改进的Feeney自由落体损伤装置制作大鼠脑损伤模型。于伤后不同时间取材,采用免疫组织化学法,检测大鼠脑组织中iNOS和caspase-3表达水平。结果 孕酮治疗组iNOS和caspase-3伤后6,24,48,72 h的表达水平分别为(11.62±1.52),(21.38±1.41),(12.94±2.73),(9.42±1.71)和(12.27±1.35),(20.57±2.92),(16.54±1.45),(10.47±1.39),与脑损伤组比较明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 孕酮可能通过抑制脑损伤后iNOS的活性,下调caspase-3的表达,起到对脑的保护作用。
关键词: 孕酮     脑损伤     诱导型一氧化氮合酶     凋亡蛋白酶    
Neuroprotective effect and its mechanism of progesterone on neurons after traumatic brain injury in rats
SI Dao-wen, MENG Jing-shan, ZHANG Ting-cai,et al    
Department of Anatomy, North China Coal Medical College, Tangshan 063000, China
Abstract: Objective To investigate the effect of proge sterone(PROG)on the expression of inducible nitric oxide synthase(NiOS)and caspase-3 in the cortex after traumatic brain injury(TBI)and to study the neuro protective effects and molecular mechanism of progesterone on TBI in rats.Methods Healthy male Spraque Dawley rats were divided at random into three groups:false operative group,TBI group and PROG treated group.The TBI of rats was duplicated with the miproved Feeneys method.The rats in the three groups were killed at 6,24,48,72,and 144 hours after the injury.The expression of iNOS and caspase-3 were examined by mimunohistochem istry.Results At the time of 6,24,48,and 72 hours after the injury,the expression of NiOS and caspase 3 in the PROG treated group were 11.62±1.52,21.38±1.41,12.94±2.73,9.42±1.71,and 12.27±1.35,20.57±2.92,16.54±1.45,10.47±1.39,respectively,and were distinctly less than those of the TBI group(18.24±1.93,43.17±3.58,20.13±3.81,13.82±2.56,and 24.56±2.71,38.23± 3.36,27.83±2.68,14.23±2.83).There were significant differences between the TBI group and the PROG treated group in the number of NiOS and caspase-3 positive cells at 6,24,48,and 72 hours after injury(P<0.05 for all).Conclusion PROG has protective effect on TBI that may relate to inhibition of NiOS activity,down regutation of caspase 3 expression.
Key words: proge sterone     traumatic brain injury(TBI)     NiOS     caspase-3    

脑损伤(traumatic brain in jury,TBI)后的继发性脑损害分子机制迄今尚未完全阐明,目前缺乏治疗继发性脑损伤的有效药物。有研究表明,孕酮(progesterone,PROG)是脑损伤后有效的神经保护剂之一〔1〕。孕酮可以减少凋亡蛋白酶 (caspase-3)的活化,抑制神经细胞凋亡〔2〕,但具体作用机制不清。本实验利用大鼠脑损伤自由落体模型,采用免疫组织化学技术,观察孕酮对大鼠脑损伤后的不同时段一氧化氮合酶(iNO S)和caspase-3表达的影响,探讨孕酮对脑保护的可能作用机制,为孕酮应用于临床治疗脑损伤提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 动物

健康雄性SD清洁级大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司SCXX (京)2007-0008)120只,体重250~ 300 g,自由进食饮水,室温(25±2)℃,单笼喂养,自然光照。

1.2 试剂

孕酮(黄体酮注射液)(天津金耀氨基酸有限公司,产品批号0404151)。兔抗人iNOS、caspase-3多克隆抗体、浓缩型免疫组织化学超敏(UltraSensitiveTM SP)试剂盒 (福州迈新生物公司)。

1.3 分组与处理

将大鼠随机分为假手术、脑损伤、孕酮治疗3组,每组40只。按照改进的Feeney自由落体损伤装置制作大鼠脑损伤模型〔3〕。大鼠麻醉后,在矢状缝后1.5 mm,中线旁2.5 mm处打开一直径5 mm骨窗,用40 g重的击锤从 25 cm处自由坠落冲击撞杆造成脑损伤,致伤冲击力约为 0.088 N•s。假手术组仅切开头皮,开同样大小骨窗而不造成脑挫伤。孕酮治疗组伤后1,6 h (腹腔),24,48,72,96,120 h皮下注射孕酮16 mg/kg。假手术组和脑损伤组在相同时间内给予等量生理盐水。各组分别于伤后6,24,48,72,144 h取材(8只/每个时间点),制片。

1.4 免疫组织化学检测

取脑组织切片,用过氧化氢阻断内源过氧化物酶,正常非免疫动物血清室温孵育,加入一抗即兔抗人iNOS、caspase-3多克隆抗体(1:100),加入二抗,二氨基联苯胺(DAB)显色,复染,封片,光镜下观察。在400倍光镜下观察,每个片子随机取5个视野观察阳性细胞数,以平均值代表计数结果。

1.5 统计分析

采用SPSS 13.0统计软件进行分析,各组间比较采用方差分析。

2 结 果 2.1 孕酮对脑损伤后iNOS表达的影响(表 1)
表 1 孕酮对大鼠TBI皮质iNOS表达影响(n = 8, x±s)

假手术组大鼠大脑皮质偶见iNOS阳性细胞;脑损伤组伤后6 h周围皮质出现阳性表达,24 h达高峰、以后逐渐下降,伤后6,24,48和 72 h假手术组与脑损伤组之间差异有统计学意义(P < 0 05);孕酮治疗组伤后iNOS阳性表达明显减少。

2.2 孕酮对脑损伤后caspase-3表达影响(表 2)
表 2 孕酮对大鼠TBI后不同时间点皮质Caspase- 3表达的影响(n = 8, x±s)

假手术组大鼠皮质可见微量caspase-3表达,脑损伤组大鼠的 caspase-3表达在伤后各时间点均明显增加,于伤后6 h表达开始增高、24 h达高峰,以后逐渐下降;与脑损伤组比较,孕酮治疗组caspase-3表达在各时间点均显著降低。

3 讨 论

研究表明,细胞凋亡是脑损伤后迟发性神经元死亡的重要机制之一,是继发性脑损伤病理机制的重要组成部分〔4〕。 caspase-3是细胞凋亡过程的最终执行者,脑损伤后iNOS诱导的一氧化氮大量产生是导致继发性脑损伤的一个重要因素〔5〕。本研究结果显示,脑损伤后损伤灶周围皮质有大量的 caspase-3和iNOS阳性表达,二者表达的趋势基本一致,提示脑损伤后iNOS可能参与诱导了中枢神经损伤后caspase- 3的表达。近年研究发现,孕酮具有减轻脑损伤后的脑水肿、清除自由基、提高动物的认知能力等,具有神经保护作用〔6, 7, 8〕,是很有潜力的脑损伤保护药物〔9〕。本实验结果显示,孕酮治疗组伤灶周围皮质iNOS和caspase-3表达明显低于损伤组,提示孕酮可能是通过抑制脑损伤后iNOS的表达,减少一氧化氮的产生,进而抑制caspase-3凋亡的级联反应,减少神经元凋亡,起到保护神经作用。

参考文献
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