中国公共卫生  2010, Vol. 26 Issue (8): 952-953   PDF    
引用本文
何树梅, 张敏, 贺拥军, 丁静, 袁尔亚. 结核分枝杆菌异烟肼耐药与KatG基因相关性[J]. 中国公共卫生, 2010, 26(8): 952-953.
HE Shu-mei, ZHANG Min, HE Yong-jun,et al. Mutations of KatG gene and isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Xinjiang[J]. Chinese Journal of Public Health, 2010, 26(8): 952-953.
结核分枝杆菌异烟肼耐药与KatG基因相关性
何树梅1, 张敏1, 贺拥军1, 丁静2, 袁尔亚1    
1. 西藏民族学院医学系, 陕西咸阳712082;
2. 新疆自治区疾病预防控制中心
收稿日期: 2010-04-08.
作者简介: 何树梅(1971- ),女,甘肃静宁人,讲师,硕士,主要从事抗感染免疫的教学研究工作。
摘要: 目的 探讨新疆地区结核分支杆菌异烟肼(INH)耐药与结核杆菌KatG基因突变和缺失的关系。方法 收集结核病患者的痰标本238份,分离培养结核杆菌分离株60株,其中异烟肼敏感株28株,耐药株32株,抽提临床菌株DNA和H37RV标准株DNA,应用聚合酶链反应-单链多态构象分析(PCR-SSCP)和测序方法对结核分支杆菌KatG基因突变进行检测。结果 238份肺结核病人痰标本,涂片抗酸杆菌阳性60例,阳性率25.2%;以结核分支杆菌H37RV为对照,28株药物敏感株的KatG,基因扩增产物273片段单链多态构象分析(SPSS)图谱均正常,32例耐INH分离株中32株KatG基因扩增阳性,其中11株SSCP图谱与H37RV株有差异,KatG突变率为34.37%。结论 新疆地区结核杆菌INH耐药率仍属于高耐药区域,新疆地区结核分支杆菌INH耐药的产生可能是其KatG基因突变所致。
关键词: 结核分支杆菌     异烟肼     耐药     KatG基因     单链多态构象分析    
Mutations of KatG gene and isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Xinjiang
HE Shu-mei, ZHANG Min, HE Yong-jun,et al    
School of Medicine, Tibet Nationalities Institute, Xianyang 712082, China
Abstract: Objective To explore the relationship betweenisoniazid(INH)resistance and Ka Gt gene mutation in Mycobacterium tube rculosis.Methods To tally 238 sputum samples were collected fromtuberculosis patients in Xinjiang and 60 Mycobacterium tuberculosis strains were isolated from the samples(28 drug susecptible strains,32 strains of inonizaid resistance or multidrugre sistance including inoniazid).Genomic DNA was extracted form Mycobacteriumtube rculosis isolates and standard strain H3TRV.The KatG gene was amplified with PCR and KatG gene mutation was detected with single strand conformation polymorphism(SSCP)and sequencing.Results The results of PCR-SSCP of 28 susceptive strains were the same with that of H37RV.KatG gene was amplified from 32 drugresistance strains succe ssfully.There were 11 cases had single pointmutation in KatGgene with amutation rate of 34.37%.Conclusion The INH resistance rate of Mycolacterium tuberculosis strains isolated from Xinjiang is among the highest in China.The KatG gene mutation is involved in INH rsistance of Mycobacterium tubeculosis.
Key words: Mcycobacterium tuberculosis     isoniazid     drugre sistance     KatGgene     SSCP    

由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的结核病是最常见人类慢性传染病之一。新疆是中国的少、边、穷省区之一,自然条件较差,是我国传染病的高发区。1979-2000年进行过4次全国结核病流行病学调查〔1〕,其结核患病率、涂阳率和死亡率的下降幅度较为明显,但各项指标均高于全国同期水平。长期以来,异烟肼(INH)一直是预防和治疗结核病最主要首选药物,对有效控制结核起到重要的作用。但近年来,随着INH的广泛使用,无论是发达国家还是发展中国家结核分支杆菌(MTB)对INH的耐药率均明显上升〔2〕。有报道〔3〕,我国INH耐药率已排在首位,INH耐药己成为结核发病率升高的三大重要原因之一。因此,为了解新疆地区结核耐药情况,降低结核发病率,于2004年对收集的238份结核杆菌痰标本进行了检测。现将结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料

(1)痰标本:结核杆菌痰标本共238份来自新疆地区结核病防治研究所及医院。均分离自肺结核患者的痰标本(包括初治及复治的结核病患者)。其中男性132例,女性 106例;年龄18~70岁。(2)菌株:从痰标本中分离培养出结核杆菌菌株。结核杆菌标准株H 37Rv (北京结核病研究所)。

1.2 方法

(1)挑取干酪样、脓性痰约0.lmL,均匀涂满玻片2 cm×2.5 cm圈,自然干燥后染色镜检。(2)耐药性测定:采用WHO推荐的比例法进行药敏试验〔4。药物浓度为INH (0 2μg/mL)。(3) PCR-SSCP实验:根据结核分支杆菌KatG基因序列(genbank accession num ble X68081 S42739)设计的引物Il (5'-GCGGCGGTCGACATT):12(5'-CTCGAGGAAACT- GTTGTCCC)可扩增该基因易发生突变的2708~2981位碱基产生273 bp片段。用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳银染鉴定突变。DNA序列测序:用双脱氧不完全阻断法进行DNA序列测定。

1.3 统计分析

采用SPSS 10.0软件进行分析,组间阳性率比较采用X2检验。

2 结 果 2.1 痰菌检出率

不同性状的痰标本痰菌检出率:依次为干酪样痰70.6%,脓性痰43.4%,粘稠性痰20%,血性痰 12.3%,泡沫样痰1.8%。干酪样痰阳性率较高,经检验,差异有统计学意义(X2=37.83,P < 0.01);干酪样痰与脓性痰之间差异无统计学意义,但干酷样痰与粘稠性痰、血性痰,泡沫样痰之间差异有统计学意义(X2=17.146,11.023,23.01,P < 0.004)。

2.2 菌种鉴定

从238份痰标本中分离出60株结核分支杆菌,其中人型结核分支杆菌55株,占91.67%:牛型结核分支杆菌2株,占3.33%;非结核分支杆菌3株,占5%。

2.3 耐药性测定

痰培养阳性率为25.21%,培养阳性菌株中,对痰标本分离培养出的60株结核分支杆菌进行异烟肼敏感性测定,其中耐INH菌株为32株,耐药率为53.33%。敏感株数为28株,初治耐药24例,初始耐药率25%:复治耐药 36例,获得性耐药率72 2%,2者差异有统计学意义(X2= 12 9,P < 0 01)。

2.4 60株结核分支杆菌PCR􀀂SSCP检测(图 1)
注: 1: H37RV结核杆菌标准株; 2,4,6: 耐INH 分离株: 3,5: INH 敏感株。 图 1 SSCP银染结果

28株INH敏感株的PCR-SSCP图谱均与H37RV相同,32株INH耐药株中,7株高度INH耐药株和4株低度INH耐药株的聚合酶毛连反应-单链多态构象分析(PCR-SSCP)图谱有差别,其余 INH耐药株的PCR-SSCP图谱与H 37RV相同。因此,以比例法药敏实验结果为对照,PCR-SSCP检测结核杆菌临床分离株 INH耐药性的敏感度为34 37%,特异性为100%,2组差异有统计学意义(X2=11.786,P <0 01)。PCR扩增产物经过序列测定其突变位点检测与PCR-SSCP检测一致。

3 讨 论

结核菌耐INH的机制比较复杂,KatG基因的突变、部分缺失是主要影响机制。该基因的完全缺失在INH耐药株中只占很小一部分但导致高度耐药〔5〕。有研究表明,KatG基因中315位AGC突变成ACC及463位CGG突变成CTG这2个突变和耐药性关系最密切〔6, 7〕。但有学者认为KatG基因中 R463/L突变无意义〔6〕。

本研究结果表明,耐INH临床分离株KatG突变率为 34.37%,未发现KatG基因完全缺失,末发现敏感株突变,特异性为100%。Hfling等从巴西人群中分离出的抗异烟肼株,KatG基因的丝氨酸315苏氨酸突变占60.4%〔8〕,与研究结果一致。本研究耐INH株中未发现KatG基因完全缺失,但并不表明KatG基因完全缺失可能不是新疆地区结核分支杆菌耐I NH产生的分子机制,需加大样本量进一步验证。对KatG基因进行DNA测序发现,10株异烟肼耐药株KatG基因315位密码子发生突变,突变株所占的比例为10/11。其中8株为常见的突变类型(AGC-ACC),另2株为国外学者报道过的突变类型(AGC-AAC),315位氨基酸由Ser突变为Asn〔9〕,己证实此突变与高耐药量有关,此突变株所占比例为2/11,提示此突变类型可能具有地区分布特点。

参考文献
〔1〕 金鑫.1979-2000年新疆结核病流行状况及坊杆对策[J].地方病通报, 2003, 18(1):50-52.
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〔4〕 世界卫生组织WHO.结核病药物耐性检测指南[S].(修订本).
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