表面加强激光解析电离-飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)技术是近年在基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱法(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)基础上改良发展起来的一种蛋白质分离技术^{〔1, 2〕}。本研究采用美国 Ciphergen公司3种不同类型的化学表面芯片(CM-10、H4、 IMAC-3-Cu),探索建立蛋白质指纹图谱的最优化条件,初步筛选出研究细胞株蛋白质的最佳芯片,评估SELDI-TOF-MS技术结合蛋白质芯片分析的可靠性和重复性,为今后的进一步研究奠定基础。

人口腔鳞癌细胞株KB (南京凯基生物技术有限公司);RPMI 1640培养基(美国Gibco公司),新生牛血清 (NBS)(杭州四季青生物材料研究所),胰蛋白酶、四甲基偶氮唑盐(MTT)(美国Amersco公司),考马斯亮蓝法(Bradford)蛋白定量试剂(上海生工生物工程有限公司);蛋白质抽提相关试剂(美国Sigma公司);能量吸收分子-芥子酸 (SPA),蛋白质芯片CM-10、IMAC-3-Cu、H4,ProteinChip Biology System (PBSⅡ-c)质谱仪,All-in-one peptid (美国Ciphergen公司)。

实验选用人口腔鳞癌细胞KB,用含 10%新生牛血清以及青链霉素各100 U/mL的RPMI 1640培养基,置37℃、5% CO₂的培养箱中培养。倒置相差显微镜观察细胞生长情况,0.25%胰蛋白酶消化传代,取对数生长期细胞用于实验。

培养至细胞铺满瓶底,KB细胞株直接用冰的磷酸缓冲液冲洗3次,按培养瓶底面积1 cm²加入10~15 μL细胞裂解液,快速混匀器混合5 s × 2次,冰上静置30 min,12 000 r/min 4℃离心20 min,取少量上清用于测定总蛋白浓度,其余上清液分装冻存于-80℃,保存备用。

Bradford法按试剂盒说明书操作。

(1)不同芯片采用相应的缓冲液进行预处理。(2)芯片检测和数据处理经校正、参数设定,设定读片程序读取芯片数据,采用Ciphergen Protein Software和BioMarker Wizard软件分别进行自动采集数据及分析蛋白质质谱图数据和蛋白质峰强度与数量的差异性,筛选差异有统计学意义的蛋白质分子量。主要采集信号噪声比(signal-to-noise,S/N)> 5为有效波峰^〔3〕,质荷比(M/Z)为2 000~50 000的蛋白峰,蛋白峰强度相差> 0.5倍者定义为差异蛋白质。由于受金属离子及基质影响,本研究将M/Z < 2 000的蛋白峰予以排除。(3)细胞全蛋白芯片筛选CM-10、IMAC-3-Cu、H4三种蛋白质芯片分别对细胞株KB建立蛋白质指纹图谱,根据蛋白质峰显示程度,选择研究用的最佳芯片。(4)最佳蛋白质芯片重复性评估同一方法在同一时间和不同时间制备多份细胞总蛋白提取样品,随机选取其中1份样品点于同一芯片和不同芯片各8个点样孔,进行蛋白质图谱检测,分别在相应的图谱中各自随机选择8个蛋白质峰,分析峰强度和M/Z的变异系数(CV)。

采用All-in-one NP20校正芯片校正阅读仪,随机选择建立的蛋白质指纹图谱中的血管加压素(vasopressin)、生长抑素(somatostatin)、强啡肽A (dynorphin A)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、牛胰岛素B链、胰岛素、水蛭素(hirudin BKHV)等7个标准蛋白或肽。实验结果表明,All-ill-one NP20激光强度140,敏感性6;CM-10芯片激光强度185,敏感性8;H4芯片激光强度215,敏感性 8;IMAC-3-Cu芯片激光强度190,敏感性8可以获得较好的蛋白质指纹图谱。

图 1

图 1 3 种蛋白质芯片获得的蛋白质指纹图谱

利用 CM-10、H4、IMAC-3-Cu 3种蛋白质芯片,分别对KB细胞总蛋白裂解液进行SELDI-TOF-MS检测,发现CM-10建立的蛋白质指纹图谱蛋白峰相对较多,H4建立的蛋白峰其次,而 IMAC-3-Cu建立的蛋白峰相对较少,可见CM-10蛋白质芯片是细胞蛋白质组学研究较好的工具。

同一样品在同一芯片和不同芯片中各随机选取8个蛋白质峰点进行分析,其峰强度分别为0.058 038,0.071 305;M/Z在芯片内的总变异系数(CV)分别为0.000 121,0.000 152。

CM-10、IMAC-3-Cu、H4这3种芯片均可检测到上百个蛋白峰,分子量均在30 000 Da以内,集中于2 000~ 15 000 Da,其主要用于小分子量的蛋白质或多肽的筛选,可与主要研究大分子量蛋白质的双向凝胶电泳(2-DE)技术形成互补。3种芯片各有特点,CM-10芯片结合细胞总蛋白裂解液较多,是肿瘤细胞蛋白研究良好工具,而IMAC-3-Cu和 H4芯片捕获的蛋白峰相对较少,故今后的实验拟采用CM-10芯片进行。重复性差是传统的蛋白质组学研究技术的主要缺点,本试验中,分别对同一芯片不同位点和不同芯片间不同位点的重复性和稳定性进行评估,发现蛋白质芯片SELDI-TOFMS技术重复性好,技术指标稳定,其重复性明显优于传统的双向凝胶电泳(2-DE)技术,表明SELDI-TOF-MS蛋白质芯片技术是较可靠的蛋白质组学研究技术平台。然而,因该技术对检测样品需要量极少,灵敏度极高,故对样品的质量控制和操作过程的标准化极为严格,这些因素将直接影响实验结果的准确性和可靠性。