中国公共卫生  2010, Vol. 26 Issue (7): 936-937   PDF    
引用本文
王菲, 陈峥宏, 康沛萍. 细胞壁缺陷幽门螺杆菌尿素酶基因活性检测[J]. 中国公共卫生, 2010, 26(7): 936-937.
WANG Fei, CHEN Zhenghong, KANG Pei-ping. Detection of urease and urease gene activities in Helibacter pylori with cell wall deficiency[J]. Chinese Journal of Public Health, 2010, 26(7): 936-937.
细胞壁缺陷幽门螺杆菌尿素酶基因活性检测
王菲, 陈峥宏, 康沛萍    
贵州省贵阳医学院微生物学教研室, 贵阳550004
收稿日期: 2009-09-25.
基金项目: 贵州省科技厅基金(黔科合J[2008]2165)
作者简介: 王菲(1981- ),女,湖北武汉人,讲师,硕士,主要从事病原微生物检测工作。
摘要: 目的 了解细胞壁缺陷变异对幽门螺杆菌尿素酶活性及其基因的影响。方法 用抗生素诱导幽门螺杆菌稳定L型(HPL)并分离培养,检测幽门螺杆菌及其稳定L型的尿素酶活性,并对HPL型及其亲代细菌型进行尿素酶结构基因UreA和UreB基因的PCR检测。结果 幽门螺杆菌可在头孢曲松钠作用下发生细胞壁缺陷变异,经传代培养可获得稳定L型的纯培养物;幽门螺杆菌尿素酶试验阳性,稳定L型的尿素酶试验则为阴性;L型及亲代细菌型UreA和UreB基因的PCR检测均可见分子量分别为400和200bp的扩增产物。结论 幽门螺杆菌在抗生素作用下可发生细胞壁缺陷变异成为L型;幽门螺杆菌L型仍然保留UreA和UreB基因。
关键词: 幽门螺杆菌     尿素酶基因     聚合酶链反应     细胞壁缺陷    
Detection of urease and urease gene activities in Helibacter pylori with cell wall deficiency
WANG Fei, CHEN Zhenghong, KANG Pei-ping    
Department of Microbiology, Guiyang Medical College, Guiyang 550004, China
Abstract: Objective To probe the effect of cell wall deficiency on urease and urease gene activity in Heliobater pylori.Methods The stable L-form of Heliobater pylori(H pyloria)were induced by ceftriaxone sodium and isolated with filtration and then subcultured in non-high osmotic medium without antibiotic.H pyloria and its L-forms were identified by PCR of 16srDNA.The UreA gene and UreB gene was amplified with the specific PCR primer and the PCR products were detected with agarose gel electroforesis.Results L-form H pyloria could be induced by ceftriaxone sodium in non-high osmotic liquid medium.The shape of L-form H pyloria were spherical or elliptical.The single or paired L-form H pyloriac arranged in chain or in pile.The stable L-forms could pass through the filter with 0.22μm aperture and be subcultured in the non-high osmotic liquid medium without antibiotic or other inducer.The 16SrRNA gene fragment could be amplified from the stable L-form H pyloria.The stable L-form derived from H pyloria had UreA gene and UreB gene with the same nucleotide sequence as that of their parental bacteria.Conclusion The cell wall deficient mutation would happen when the H pyloria is treated with ceftriaxone sodium,and the pure culture of stable L-form strains could be isolated with filtration and then subcultured in nonhigh osmotic medium without antibiotic.The stable L-form strains derived from H pyloria have UreA and UreB gene with the same nucleotide sequence as that of their parental bacteria.
Key words: Heliobater pylori     urease gene     PCR     cell wall deficiency    

幽门螺杆菌(HP)是定植于人胃部的一种革兰阴性细菌,与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等疾病的发生密切相关。HP的致病机制复杂,与HP的毒力、感染引起的炎症和免疫反应及宿主自身的抵抗力有关。尿素酶是HP感染的首要因素〔1〕,能使HP定植于胃粘膜上皮细胞。HP圆球形转化被认为与HP感染的迁延不愈、反复发作有关。细胞壁缺陷变异属于HP圆球形变异。本研究通过抗生素诱导和非高渗透压培养基培养获得幽门螺杆菌稳定L型,以检测细菌型及L型的尿素酶活性,观察细胞壁缺陷对HP尿素酶活性的影响。

1 材料与方法 1.1 试剂与仪器

哥伦比亚培养基(英国OXOID公司);布氏肉汤(北京奥博星生物技术有限公司);幽门螺杆菌选择添加剂(北京友康生物科技有限公司);微需氧产气袋、厌氧罐 (日本三菱公司);尿素酶培养基(20%的尿素酶布氏肉汤培养基);DP302-02柱式细菌基因抽提试剂盒(北京天根生物工程有限公司);基因引物(北京天根生物工程有限公司合成)。HP菌株SS1、NCTC11637(中国疾病预防控制中心传染病预防控制所)。

1.2 HPL型的诱导、分离和传代培养

取HP菌株接种于 7%哥伦比亚血琼脂平板(含5 mg/L多粘菌素,10 mg/L两性霉素,10 mg/L万古霉素),微需氧产气袋于厌氧罐内37℃孵育2~3 d。取平板上HP纯培养物于含不同浓度头孢曲松钠的布氏肉汤进行L型的诱导,L型形成后经0.22 μm滤菌器过滤除去细菌型,并用布氏肉汤进行传代培养。传5代后,收集L型培养物,进行革兰染色、细胞壁染色。

1.3 HPL型的PCR鉴定

采用细菌基因组DNA抽提试剂盒,分别提取HP、HPL总DNA,以此作为模板,进行16SrRNA的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测〔2〕。

1.4 尿素酶试验

按照试剂盒操作,将定量的HP及HPL纯培养物接种于尿素酶培养基中进行培养。

1.5 UreA和UreB基因检测

参考文献〔3〕合成HP的Ure- A和UreB基因的引物,UreA基因上游引物(UreAFor ):5'- GCCATTGGTAAATTAGTT-3'下游引物(UreArev )5'-CTCCTTAATTGTTTTTAG -3';UreB基因上游引物(UreBFor ):5'- CAAAGACATGCAAGATGGCG-3',下游引物(UreBrev ):5'- TGATAGTGGTTGCGTTAGTG-3';用已提取的HP、HPL基因 DNA作为模板,进行UreA和UreB基因的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结 果 2.1 HPL型的诱导、传代培养

HP菌株在头孢曲松钠作用下可形成L型圆球体,可在不含抗生素的布氏肉汤中传代培养,于倒置显微镜下可见HPL型为圆球或卵圆形,单个、成双、成链状或成堆排列,沉于瓶底,不运动。革兰染色阴性,细胞壁染色阴性。

2.2 尿素酶试验

HP细菌型使培养基由黄色变为红色,尿素酶试验阳性,而HPL纯培养物未使培养基变色,尿素酶试验阴性。

2.3 HPL型的鉴定(图 1)
注:1. SS1;2:SS1 L 型;3:NCTC11637;4:NCTC11637 L 型;5:阴性对照。 图 1 HP 及HPL 16SrDNAPCR 产物琼脂糖凝胶电泳结果

HP及HPL 16SrRNA基因PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳,可见片段大小约为550bp的DNA条带。

2.4 UreA和UreB基因检测(图 2)
注:UreA 基因:1:SS1;2:SS1 L 型;3:NCTC11637;4:NCTC11637 L 型; UreB 基因:5:SS1 6:SS1 L 型;7:NCTC11637;8:NCTC11637 L 型 图 2 HP 及HPL UreA 和UreB 基因PCR 产物琼脂糖凝胶电泳结果

细菌型与L型的UreA基因扩增可见片段大小约为400 bp的DNA条带,而UreB基因的PCR扩增可见片段大小约为200 bp的DNA条带。

3 讨 论

细菌L型是指完全丧失细胞壁、不能自发返祖但可生长繁殖的细胞壁缺陷细菌〔4, 5〕。HP容易发生细胞壁缺陷,抗生素、营养匮乏等不利生长因素均可诱导HP形成L型。本研究采用抗生素诱导,非高渗透压培养基培养法成功获得了HP稳定L型,其形态、染色特性及某些生长代谢特性包括尿素酶活性均与亲代细菌型不同。本研究结果表明,HP发生细胞壁缺陷变异后,尿素酶试验转为阴性。然而,对尿素酶结构基因〔6〕UreA和UreB的PCR扩增结果表明,HPL型保留了和细菌型分子量一致的尿素酶结构基因。尿素酶试验阴性的原因可能是HPL生长代谢能力较细菌型明显降低所致。

细胞壁缺陷可致HP产生空泡毒素的能力减弱〔7〕,并使尿素酶分泌降低,因此,HPL型的致病性可能弱于亲代细菌型。如果抗生素治疗不规范,HP可以通过转化为L型潜伏在机体中,并且有可能在适宜的条件下回复毒力,引起疾病复发,成为消化性疾病难以根治的原因之一。

参考文献
〔1〕 盛涛,张建中.幽门螺杆菌尿素酶研究现状[J].世界华人消化杂志,1999,7(10):881-884.
〔2〕 王菲,陈峥宏,赵亮.用PCR扩增16SrRNA基因鉴定幽门螺杆菌的细胞壁缺陷型[J].贵阳医学院学报,2009,3(34):259-261.
〔3〕 佘菲菲,丁惠,林建银,等.球形与螺旋形幽门螺杆菌基因表达差异的研究[J].中国微生态学杂志,2003,15(3):131-133.
〔4〕 王和.男性生殖系统感染症的治疗[M].贵州:贵州科技出版社,2001:121-136.
〔5〕 易旭,王和.细胞壁缺陷对白喉棒状杆菌Tox基因的影响[J]. 中国公共卫生,2006,22(12):1462-1463.
〔6〕 Sisto F,Brenciaglia MI,Scaltrito MM,et,al.Helicobater pylori urea,cagA and vacA expression during conversion to the coccoid form[J].Int J Antimicrob Agents,2000,15(4):277-282.
〔7〕 陈峥宏,王菲,赵亮.细胞壁缺陷对幽门螺杆菌空泡毒性作用的影响[J].山东医药,2009,49(1):14-16.