2010, Vol. 26
表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术(surface-enhanced laserdesorption/ionization-time of flight-mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)是近年发展起来的蛋白质组学研究前沿技术〔1〕。2001年以来,国内外许多文献报道介绍了用SELDI-TOF-MS技术分析血浆/血清等人体液中的差异表达蛋白质图谱,发现多种肿瘤等疾病如卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肾癌、肺癌等相关生物标志物〔2〕。随着研究深入,SELDI-TOF-MS技术在生物医学中研究中重现性较差,引起了人们注意〔3, 4, 5〕。由于逐渐发现和了解SELDI-TOF-MS技术应用于生物医学研究中的问题和局限性,导致对SELDITOF-MS技术的血浆/血清蛋白质图谱产生争议〔5, 6, 7〕。本研究对该技术在生物医学研究中若干方法学上问题及其局限性作一综述。
1 样品处理SELDI-TOF-MS技术应用于血浆/血清等生物样品的蛋白质图谱,它理论上是反映在某一时间节点,某一特定状态下,在这些生物样品中,各种多肽和蛋白质分布及相应含量的全景图谱。血浆/血清等样品富含各种生物活性物质,离体后仍可存在并经历各种生化反应,如外源蛋白酶水解、凝结过程或血小板活性作用等等。而这些作用都可能影响样品蛋白质图谱模式。如室温下存放8 h的血浆样品和存放4 h血浆样品的SELDI-TOF-MS蛋白质图谱有明显差异〔8〕。有研究用6种不同方法处理样品,并分别应用CM10蛋白芯片、铜离子鳌合蛋白芯片(IMAC30-Cu)和H50芯片吸附,进行SELDITOF-MS检测,研究样品预处理对SELDI-TOF-MS蛋白质图谱影响〔9〕。结果表明,在预处理中,按规范化操作步骤处理(抽血后,凝结60 min,放冰中运送,-80℃储存)和按非规范化操作步骤处理(抽血后,室温30 h后离心)的各自血清样品蛋白质图谱变异最小,而后一种方法在SELDI-TOF-MS蛋白质图谱的较低分子量范围中(2.5~20 kDa)出现的质谱峰数和相对丰度有所增加,而在20~200 kDa范围内,无此现象。
由于样品的转送过程,储存期延长等因素,血浆/血清样品中有些蛋白,如间α-胰酶抑制剂重链H4,过敏毒素C3a,C1抑制物及其修饰物等容易水解,导致蛋白质图谱中降解产物峰相对丰度增加;相反全长血红蛋白α和β则可能因为被水解,而使图谱中对应峰的相对丰度降低〔9〕。这种因为血浆/血清样品中某些蛋白不稳定,被不同程度水解而产生的蛋白质图谱的峰模式或峰相对丰度变化,可能会影响结果判断,是导致实验重复性差原因之一〔9, 10〕。因此,应当关注血样采集、凝结、转送、储存等样品预处理方法步骤的一致性和标准化。
2 血浆/血清样品芯片层析阻留吸附SELDI-TOF-MS技术最先由Hutcheus等创建〔11〕,是结合层析阻留技术和基质辅助激光解析电离质谱(MALDI-TOFMS)的杂合技术。SELDI-TOF-MS技术应用表面含层析材料的芯片,以弱阳离子交换、强阳离子交换、金属离子鏊和、疏水作用、亲水作用等层析阻留作用,将复杂生物样品中具有相应化学特性的多肽和蛋白质选择性阻留吸附于芯片表面,从而对样品起到初步分离浓缩作用,利于SELDI-TOF-MS检测。
血浆和血清中具有10000余种不同蛋白质,其中0.2%种类蛋白质占血浆/血清总蛋白量的99%。如97%~99%是白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原、急性期蛋白(acute-phase proteins)、转铁蛋白和脂蛋白等。许多在生理过程中起重要作用的蛋白质、多肽,以极低浓度存在于血浆/血清中。血浆/血清蛋白质浓度在10-3~10-12 mol/L,至少在9个数量级的巨大变量范围内〔12, 13, 14〕。血浆/血清蛋白质和多肽与SELDI-TOFMS技术的芯片表面层析材料作用过程,也遵循离子交换过程原理。表面层析材料种类、离子交换容量、被分离材料种类、与层析材料亲和性、样品中含量、吸附条件等都会影响层析阻留吸附结果。SELDI-TOF-MS技术中所采用的蛋白芯片表面层析材料结合容量有限(如CM10芯片,估计结合容量约为2~5 pmol〔15〕),而通常加样量远大于芯片表面层析材料结合容量。因此,与表面层析材料结合过程中,血浆/血清中各种多肽和蛋白质将对表面层析材料结合位点发生竞争性结合。低亲合力高浓度多肽和蛋白质与高亲和力低浓度多肽和蛋白质,可能在SELDI-TOF-MS蛋白质组图谱上产生相似丰度质谱峰,或相对丰度与实际浓度相反质谱峰。Van Breemen等〔15〕应用ELISA法检测加样到CM10芯片前后,不同血浆样品中趋化因子18(CCL 18)蛋白(7.8 kDa,血浆中含量在nmol/L范围)含量,推算出真正结合到芯片表面的CCL 18蛋白,仅占所加血浆样品中的1%~10%。因此,在SELDITOF-MS蛋白质图谱各峰相对丰度与相对丰度之比,可能并不完全代表实际样品中各自对应的多肽、蛋白质浓度之比。
3 SELDI-TOF-MS技术的血浆/血清蛋白质图谱SELDI-TOF-MS技术对小分子量(尤其是1~10 kDa)多肽、蛋白质有较好分辨率,弥补了双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)不能有效分辨小分子量多肽和蛋白质的技术缺陷。SELDI-TOF-MS技术对大分子量蛋白质检测分辨率有欠缺,尽管有文献报道SELDI-TOF-MS技术可用于鉴别分子量高至250 kDa的潜在蛋白标志物〔16〕,但一般来说,对分子量高于20 kDa蛋白质分辨率是不能令人满意的。
SELDI-TOF-MS技术应用于疾病相关生物标志物筛选研究时,采用了质谱图谱中质谱峰的m/z值,对应不同多肽和蛋白质分子量;同时采用了各质谱峰的相对丰度,对应特定分子量多肽和蛋白质的相对含量。用这2类数据构成被检血浆/血清样品蛋白质图谱,并以此来研究各样品间蛋白质组的差异表达与疾病关系,从中发现与疾病相关多肽和蛋白质生物标志物。
SELDI-TOF-MS技术是基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术的一种扩展与延伸,它对多肽和蛋白质半定量检测的准确性有所改进。它采用了水凝胶作层析材料支持物,增强对蛋白质的捕获能力,保护了蛋白质形态,同时水凝胶网状结构可使蛋白质-基质形成均匀的共结晶层,通过特别设计软件,对质谱图谱信号标准化处理,最后使多肽和蛋白质峰相对丰度可用于比较分析〔16, 17, 18〕。但SELDITOF-MS技术也存在多肽和蛋白质定量检测的线性范围和血浆/血清蛋白质组中各种多肽和蛋白质浓度分布匹配问题。Vorderwulbecke等〔17〕在1%的血清中,对肌红蛋白(1.695 1 kDa)定量,结果,从1~125,125~2 000 nmol/L范围内,峰的相对丰度与肌红蛋白浓度有很好线性关系。
SELDI-TOF-MS技术与MALDI-TOF-MS技术也具有共同特点,如离子化信号的相互抑制。高度疏水性多肽具有很大抑制影响〔19〕,信号相对丰度也深受多肽和蛋白质组成的影响,精氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸或脯氨酸可以改善解析/离子化,因此有较高的信号丰度〔20〕。但多肽和蛋白质的解析和离子化过程依然没有被完全认识。不同序列多肽,甚至序列完全相同,但来自不同MALDI点,肽的电离效率可能完全不同〔21〕。SELDI-TOF-MS技术的血浆/血清蛋白质图谱中各多肽和蛋白质峰相对丰度,可能会因样品中各种成分互相干扰而受影响。Van Breemen等〔15〕用CM10芯片吸附血浆样品中趋化因子CCL18蛋白,用ELASI法定量检测吸附前后血浆中CCL18蛋白含量,找出不同血浆样品经CM10芯片吸附后,吸附于芯片表面的CCL18蛋白量相同加样吸附点,经SELDITOF-MS技术检测,得到不同样品的CCL 18蛋白峰相对丰度差异可达6.13倍之多。因而SELDI-TOF-MS技术在检测中,受血浆/血清中不同成分的干扰,可能导致图谱中峰相对丰度并不对应样品中相应多肽和蛋白质实际浓度,两者可能并不成相同的比例关系;甚至各样品中同种多肽和蛋白质因受不同干扰,而使得各自相对丰度无法相互比较〔15, 22〕。
4 SELDI-TOF-MS技术的质量控制SELDI-TOF-MS技术的血浆/血清蛋白质图谱,检测数据有2大类:对应被检多肽和蛋白质分子量的质谱峰质荷比(m/z);对应被检多肽和蛋白质浓度的质谱信号峰相对丰度。SELDI-TOF-MS技术的质量控制,最终体现在对这2类数据的真实性、可靠性、准确性、可重复性等控制。
4.1针对样品预处理各环节进行质量控制,国际蛋白质组织血浆蛋白组计划(HUPO PPP)工作组制定一个表格,要求参加实验的实验室详细填写制备参考样品试验流程和相应结果〔23〕。这对SELDI-TOF-MS技术的血浆/血清等样品预处理方法的标准化规范化是一个很好示范。
4.2针对SELDI-TOF-MS仪器校准,生产公司提供一些标准品,可对仪器测定分子量进行标定、校准;还可提供定标血清,在3个峰值处,其相对丰度符合要求,则认为仪器检测质量可以保证。美国国家癌症协会早期检测研究小组发起多机构对"SELDI-TOF-MS技术的血清蛋白图谱检测前列腺癌的评估"〔24〕,通过检测标准血清样品所得峰值精确性、分辨率、信噪比及3个峰的相对丰度,而使实验室仪器检测具可比性。
4.3在样品内加入内质控(internal control,IC通常称内标)。由于SELDI-TOF-MS技术的特点,加入内标可能因为理化特性在整个检测过程中对样品造成干扰,同时可能因为内标物质的序列特性与被检样品中多肽和蛋白质相差甚远,整个检测过程中内标回收率不能很好地指示被检多肽和蛋白质的回收率,起不到内标作用。SELDI-TOF-MS技术这种特殊性,决定了其质控品和标准品制备的困难程度,因而该系统标准品选择和制备工作进展相对缓慢〔25〕。
5 展 望随着对SELDI-TOF-MS技术中样品预处理重要性的了解,加强建立血浆/血清样品采集、转运、储存等分析前样品预处理方法步骤的统一性和标准化,将会越来越受到重视。随着仪器与方法学的改良(如仪器升级、磁珠技术应用等等),SELDI-TOF-MS技术的检测灵敏度,分辨率和重复性将会得到改善。同时随着对SELDI-TOF-MS技术血浆/血清蛋白质图谱的优点与局限性的深入了解,在不断寻找和研制出适合此技术的质控品和标准品基础上,应用严格质量控制和标准化规范,有望世界各地实验室SELDI-TOF-MS技术产生的蛋白质图谱的各数值资料具有可重复性、可传承性、可比较性、可溯源性。为SELDI-TOF-MS技术在疾病生物标志物研究提供方法学依据。
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