三聚氰胺是常用化工原料之一。2007年三聚氰胺奶粉导致许多婴幼儿出现泌尿系统结石^{〔1, 2〕},成为影响较大的严重公共卫生事件。同时美国发生多起因三聚氰胺引起的猫、狗等宠物中毒死亡事件^〔3〕。文献报道^{〔3, 4〕},三聚氰胺可引起泌尿系统结石、肾功能损害甚至肾衰,泌尿系统肿瘤。为探讨三聚氰胺与泌尿系统肿瘤关系,本研究采用SD大鼠经口灌胃染毒,观察三聚氰胺染毒后大鼠肾组织中c-myc、c-fos和N-ras等原癌基因表达水平,为进一步研究其致病机制提供科学依据。

三聚氰胺(上海国药集团化学试剂有限公司),白色结晶,纯度≥99%。MX4000型荧光定量PCR仪(美国 Stratagene公司)。

SPF级SD大鼠(广东省医学实验动物中心),于实验前饲养观察5 d。将动物随机分成对照组和三聚氰胺高、中、低剂量组,每组10只,雄雌各半。根据三聚氰胺急性毒性将本试验染毒剂量设计为雌、雄大鼠高、中、低剂量组分别为600,300,150 mg/kg和800,400,200 mg/kg。采用实验室超纯水配制三聚氰胺。动物每天上午灌胃染毒1次,灌胃体积1 mL/100 g体重,每周7 d,连续染毒28 d。

取肾脏90 mg,加液氮2~3 mL冷冻后研磨成匀浆状,分别加入1mL Trizol,按说明书提取RNA。然后采用反转录试剂盒(日本TaKaRa公司)将 RNA反转录成cDNA,反转录反应条件为37℃ 15 min,85℃ 5 s。cDNA于-20℃冰箱保存。

c-myc、c-fos、N-ras和β-actin引物由TaKaRa生物公司合成,引物序列如下:c-myc:5'- GCTCGCCCAAATCCTGTACCT-3'(上游),5'-TTTCCACAGACACCACATCAATTTC- 3'(下游);c-fos:5'-CGGGTTTCAACGCGGACTA C-3'(上游),5'-AAAGTTGGCACTAGAGA CGGACAGA-3'(下游);N-ras:3'-AGCAGTGAGGATGGCACT CAAG-5'(上游),3'-GATGT CAGAACCAGGGCATCAG- 5'(下游);β-actin:5'-TAAAGACCTCTATGCC AA CACAG- 3'(上游),5'-CACGATGGAGGGG CCGGAC TCA TC- 3'(下游)。按试剂盒操作。荧光定量PCR扩增采用2步法,反应条件为:95℃ 10 s 1个循环,然后95℃ 5 s,60℃ 32 s,共40个循环。以β-actin表达量为内参,对照组c-myc、c-fos和N-ras mRNA表达水平分别设为100%,三聚氰胺实验组c-myc 、c-fos和N-ras mRNA相对表达量以对照组百分比进行计算。

采用SPSS 13.0统计软件进行分析,均数间进行单因素方差分析,检验水准为α=0.05。

表 1

表 1 雄性大鼠c-myc c-fos 和N-ras mRNA 表达(x ± s)

表 1 雄性大鼠c-myc c-fos 和N-ras mRNA 表达(x ± s)

结果显示,雄性大鼠染毒三聚氰胺后各剂量组c-myc、c-fos、N-ras mRNA相对表达水平升高,与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.05或P <0.01)。

表 2

表 2 雌性大鼠c-myc，c-fos 和N-ras mRNA 表达(x ± s)

表 2 雌性大鼠c-myc，c-fos 和N-ras mRNA 表达(x ± s)

雌性大鼠染毒三聚氰胺后各剂量组c-myc、c-fos、N-ras mRNA相对表达水平也明显升高,与对照组比较差异有统计学意义(P <0.05或P <0.01)。

有报道,动物摄入三聚氰胺后会引起膀胱结石、肾结石,造成生殖、泌尿系统的损害,并可进一步诱发膀胱癌^{〔5, 6〕}。实验结果表明,连续36周给F 344大鼠饲喂1%~3%三聚氰胺后,膀胱癌发生率明显增加。WHO公布的资料显示^〔7〕,人和动物如果长期摄入三聚氰胺,会造成生殖、泌尿系统的损害,其较强的粘性,可吸附形成结石的草酸、鞣酸及钙等物质,沉积于泌尿系统,形成肾、输尿管和膀胱结石,还可诱发膀胱癌。癌症发生往往与机体内某些癌基因激活或过度表达有关,癌基因显性作用与抗癌基因的失活是肿瘤发生的分子基础,现认为肿瘤是多种癌基因多阶段途径协同作用的结果。有报道^〔8〕,膀胱癌中癌基因和抑癌基因表达水平改变。c-myc、c-fos和N-ras均属于原癌基因。本研究结果提示,三聚氰胺染毒可使大鼠肾组织中c-myc、c-fos和N-ras表达明显升高,这些原癌基因的高表达也许与三聚氰胺致泌尿系统肿瘤存在一定的关系,值得进一步研究。