自1991年碳纳米管(carbonnanotube,CNTs)^〔1〕被发现以来就因其独特力学、电学等性质而受到广泛关注。在结构上,CNTs可分为单壁碳纳米管(single-walledcarbonnanotube,SWCNTs)和多壁碳纳米管(multi-walledcarbonnanotube,MWCNTs)2种。随着研究深入,人们发现CNTs可能在生物医用领域有着广泛应用前景。但与其他纳米材料^〔2〕一样,CNTs的生物安全性问题也成为关注焦点^〔3〕。由于粒径极小,CNTs可能通过简单扩散或渗透方式经过肺部气血屏障或经皮肤进入体内,并在主要器官中分布沉积^{〔4, 5, 6〕}。因此,对CNTs开展应用安全性研究,特别是涉及到生物医学方面的应用研究十分必要。本文针对该方面的研究进展作一综述。

1 碳纳米管毒性的体内实验研究 1.1 呼吸系统毒性研究

研究表明,直径＜2.5μm的颗粒可以进入肺泡,与肺泡上皮细胞和巨噬细胞发生相互作用^〔7〕。这些颗粒一旦进入肺部就会激发活性氧(ROS)产生,从而引起炎症和细胞毒性^〔8〕。微小的颗粒甚至可能进入血液循环系统以及体内的其他器官^{〔6, 9〕}。Huczko等^〔10〕报道,在注入25mg未经纯化的CNTs(含有杂质Co和Ni)4周后,并没有导致豚鼠肺部功能异常或引起其他病变。Lam等^〔11〕将含SWCNTs悬浮液通过支气管注入大鼠和小鼠肺部,同时设置碳黑和石英对照,发现注入0.5mg碳纳米管小鼠均出现严重肺部炎症,其毒性明显高于对照组,并且表现出与碳纳米管的剂量依赖性。第7d和90d后,组织病理学检验结果表明,所有的颗粒都会以一定方式进入肺泡,这些颗粒甚至在长达90d后仍停留在肺部。对照碳黑颗粒只引起小鼠肺部轻微炎症,而SWCNTs则引起肺部上皮细胞肉芽肿形成,毒性甚至超过石英。Lam等^〔12〕在实验基础上对SWCNTs吸入染毒方式毒性做了估计,认为如果人长期暴露在悬浮有大量CNTs的空气中,将对其肺部健康造成很大威胁。同样采用注入染毒方法,Warheit等^〔13〕采用支气管肺泡灌洗方法发现,SWCNTs可以导致肺部肉芽肿和其他炎症的产生,并认为包括肉芽肿在内的肺部损伤分布不均匀而且是非渐进性,与CNTs之间无剂量依赖性。出现这种特殊现象可能与支气管注入CNTs聚集成团有关。Shvedova等^〔14〕将SWCNTs的水悬浮液置于小鼠的咽部,通过呼吸过程让水滴进入肺部。验证了肺部肉芽肿和CNTs之间的剂量依赖性。同时还发现,CNTs对于肺泡细胞有损伤。AT-I型肺泡细胞出现凋亡。肺部功能检测还表明,伴随着SWCNTs的不断聚集,呼吸功能出现缺陷,细菌清除速度明显减慢。Muller等^〔15〕将研磨前后MWCNTs分别注入小鼠肺部,发现60d后2种CNTs都依然存在于肺部,不能被自然代谢清除,而且都造成了肺部炎症和纤维化反应。试验表明,研磨后CNTs较普通CNTs而言在肺部组织中的分散性好,引起了明显剂量依赖性炎症。同时发现,肺部对普通CNTs清除速度缓慢(60d时仍剩余81.2%);而对于研磨过CNTs则清除很快(60d时剩余36%)。CNTs可能通过鼻腔,穿过血脑屏障进入脑部,对神经系统产生影响^〔16〕。将小鼠用4种途径(气管内滴注、经鼻吸入、经口摄入、腹腔内注射)进行MWCNTs染毒。结果显示,气管内注入途径染毒的毒性远大于其他3种染毒途径^〔17〕。

1.2 其他体内毒性及CNTs组织分布

Huczko等^〔18〕通过2种常规皮肤病学测试研究了CNTs对皮肤刺激作用。首先对有着过敏性皮肤的40名志愿者进行了斑贴实验,将浸有CNTs悬浮液的滤纸贴在皮肤表面并保持96h,皮肤没有发炎或过敏反应。此外在家兔眼中滴入CNTs悬浮液0.2mL,没有发现异常情况。然而后来的许多体外皮肤细胞实验提出了相反观点^〔19〕。Li等^〔20〕研究了CNTs对大动脉中线粒体DNA影响,并报道了CNTs对DNA的剂量依赖性损害,认为这种氧化损伤与心脏炎症基因表达改变有关。进一步研究发现,主动脉区域斑块比对照组有明显增加,在小鼠头臂动脉中可见动脉粥样硬化病变。

王海芳等^〔9〕研究了直径1.4nm、长400nm的水溶性羟基CNTs在小鼠体内的分布及代谢过程。结果显示,CNTs在胃、肾脏和骨骼中蓄积最多。进一步用静脉注射的方法,将牛磺酸修饰的MWCNTs注入小鼠体内,用¹⁴C做示踪原子,发现CNTs在肝部聚集沉积,肝部的巨噬细胞(Kupffercells)中明显有CNTs滞留。采用未经修饰的纯SWCNTs,通过在CNTs骨架中添加¹³C作为示踪原子,观察SWCNTs在小鼠体内分布。结果显示,SWCNTs在小鼠全身均有分布,但主要沉积在肺、肝和脾组织中,并持续相当长时间(超过28d)。对可能吸收机制进行分析发现,对CNTs的快速吸收是通过网状内皮组织中的单核噬菌细胞完成的。这一结果与之前利用化学修饰的CNTs得到的分布^〔9〕并不相同。

2 CNTs毒性的体外实验研究 2.1 CNTs对上皮细胞毒性

Shvedova等^〔19〕利用人表皮角质细胞(humanepidermalkeratinocytes,HEKs)和未纯化的HiPcoSWCNTs(含有30%的Fe)以不同的浓度在37℃下孵育18h,发现SWCNTs使细胞产生氧化应激反应并失活。而且SWCNTs的暴露使HEKs细胞的超微结构和形态发生变化。NancyA等^〔21〕通过对MWCNTs和HEKs研究得出不同结论:化学修饰后水溶性MWCNTs作用后,在细胞内检测到促炎症细胞因子产生,并伴随着细胞活性时间和剂量依赖性降低。Monteiro-Riviere等^〔21〕还发现,用角质化细胞生长介质悬浮MWCNTs后处理人表皮角质细胞,发现胞浆中出现许多空泡,大多数空泡中含有不同尺寸MWCNTs,最长可达3.6μm,有些空泡甚至穿透核膜。

2.2 CNTs对巨噬细胞毒性研究

Muller^〔15〕和贾光等^〔22〕分别研究了CNTs对巨噬细胞的作用和影响。Muller通过测试促炎症细胞因子(TNF-α)mRNA表达发现,研磨后MWCNTs可以引起剂量依赖性细胞毒性。贾光等研究了SWCNTs对肺部巨噬细胞影响,得出对于巨噬细胞的毒性SWCNTs>MWC-NTs>二氧化硅>C₆₀的结论。Manna等^〔23〕使用同种SWCNTs对人角质细胞、人表皮细胞、人肺癌细胞(A549、H1299)进行细胞存活力研究,提示CNTs对细胞存活力损害作用可能有共同机制。CNTs可能触发了某种特殊的信号转导通路,而这种通路的下游效应是导致细胞凋亡。

2.3 CNTs细胞毒性机制

Raja等^〔24〕研究了SWCNTs对鼠动脉平滑肌细胞(SMC)作用。观察显示,SWCNTs对鼠动脉平滑肌细胞有剂量依赖增殖抑制作用。通过与活性炭作用对比,发现这种增殖抑制和所用纳米粒子尺寸、剂量以及作用时间有关。崔大祥等^〔25〕研究发现,SWCNTs对人胚胎肾细胞(humanembryonickidney,HEK293)增殖有抑制作用。随着SWCNTs用量增加和时间推移,活性HEK293数量逐渐减少。显微镜下观察发现,SWCNTs的作用导致细胞凋亡。另外,SWCNTs对HEK293的细胞黏附性也有影响。Manna^〔26〕等讨论了核转录因子(NuclearFactor-kappaB,NF-B)对于CNTs毒性机制。CNTs可以促使巨噬细胞中肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)和角质细胞中氧化应激的产生^〔27〕。TNF-α和氧化损伤都会诱发NF-B。通过电泳迁移率变动分析(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)方法,第一次发现活化NF-B在细胞氧化损伤中起重要作用,并呈现出剂量依赖性规律。

2.4 CNTs细胞毒性研究存在的问题 2.4.1 细胞毒性检测方法

目前比较常用的是甲基噻唑基四唑(methylthiazolyltetrazolium,MTT)比色法。而研究表明,MTT法在检测CNTs细胞毒性时并不十分准确,存在假阳性问题。Worle-Knirsch等^〔28〕用不同纯度CNTs进行染毒对照,研究小鼠肺部巨噬细胞和人肺部上皮细胞,同样没有发现细胞活性降低。但在用2种不同方法检测细胞活性时,得出了不同结果。MTT法显示CNTs作用的细胞活性明显降低,而可溶性噻唑盐(WST)法显示某些CNTs在最大剂量时才表现出细胞活性减少。MTT复合物可能与CNTs反应,形成复杂结合物,导致其不能被二甲基亚砜溶解,从而使吸光度下降,造成细胞活力下降假象^〔29〕。在关于磷酰胆碱修饰CNTs的细胞毒性研究中^〔30〕,分别用MTT和WST-1法对大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤克隆化细胞株(clonalpheochromocytomacells,PC12)和人结肠腺癌上皮细胞(humancoloncarcinomacelllines,Caco-2)进行了细胞活性检测。MTT检测同样出现了部分假阳性结果。

2.4.2 CNTs在溶剂中分散及与细胞接触

在体外实验中,CNTs作为一种物理因素直接与细胞接触,对于CNTs细胞毒性研究首要问题是CNTs分散,未经修饰的CNTs难溶于水,且在溶液中极易团聚。尽管可以采用物理方法加入表面活性剂进行分散得到CNTs悬浮液,或者采用化学修饰方法以提高CNTs分散性,但无论哪种方法都部分改变了CNTs性状,引入了对实验产生干扰的物质。所以目前多采用直接将CNTs加入培养基或生理盐水中进行超声分散方法,但许多研究并未给出CNTs在溶剂中的实际分散状态。因为无论是贴壁细胞还是悬浮细胞,在染毒过程中一旦CNTs沉降,实际与细胞接触的CNTs就只有一层,CNTs悬浮液的浓度指标就失去了意义。

3 小结

综上所述,近年来关于CNTs毒性的研究报道,对于其在生物体中作用和反应已经有了一些共识。然而染毒方式、检测手段、暴露时间和剂量以及CNTs本身的差异导致了结论在不同程度上的分歧,大部分毒性作用机制还有待于进一步研究。对于体内毒性(invivo)研究,需要采用更多染毒方式,特别是接近实际染毒情况的吸入染毒,要保证CNTs在空气中分布均匀、不团聚;以及排除其他因素干扰。对于体外毒性(invitro)研究,希望能找到最为有效可靠的检测方法,并针对作用机制提出理论解释。