G蛋白是质膜蛋白的一种,属于广泛存在的信号转导蛋白^〔1〕。G蛋白与具有7个跨膜结构的细胞膜受体偶联,介导复杂的细胞信号转导过程^〔2〕。三聚体G蛋白由α、β、γ3类亚单位组成,其中β和γ亚单位一般以􀀁􀀂聚合体形式存在,βγ亚单位作为一个功能单位参与信号传递^〔3〕。有研究表明,Gβγ不仅能够介导独立信号传递通路,而且可能是G蛋白与其他信号通路进行交互转导的调控点^〔4〕。乙酰胆碱m2受体 (mAChR2)和β2-肾上腺素能受体(β2-AR)分别属于G蛋白偶联受体的不同亚型,可以与G蛋白结合,同时受到G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)磷酸化的调节^〔1〕。本研究通过观察Gβγ对mAChR2和β2-AR磷酸化过程的影响,探讨G蛋白βγ亚基影响G蛋白偶联受体的磷酸化作用机制。

〔γ-P³²〕三磷酸腺苷(ATP)和〔γ-S³⁵〕三磷酸鸟苷(GTP)(新英格兰Nuclear Life Science Products公司);重组β2-肾上腺素受体膜蛋白和氨基苯羟脱品(ABT)、氨甲酰胆碱、阿托品和肝素(美国Sigma公司);环氧树脂活化琼脂糖凝胶6B、二乙胺基乙基纤维素(DEAF)-琼脂糖凝胶 FF、层析柱(美国Pharmacia公司);GRK2(日本第一制药公司)。

采用W istar大鼠(中国医科大学动物实验室)脑组织,普通肉食猪脑组织(市售)。

βγ亚基分离纯化􀀁根据H aga K^〔5〕方法,利用大鼠脑组织分离制备mAChR2(分子量约为68 000 Da)。根据Kotani K^〔6〕方法,利用猪脑组织分离纯化G蛋白 βγ亚基。Gβ相对分子量约为36 000 Da,Gγ相对分子量约为10 000 Da。

磷酸化在一个30 μL的反应体系中完成。反应体系中含有mAChR2,Tris-HCl缓冲液 (pH 7.4),乙二胺甲乙酸(EDTA),GRK2,mAChR2,G〔γ- P³²〕ATP。每一反应体系开始时加入〔γ-P32〕ATP,30℃保温60 min;二十烷基硫酸钠(SDS)5 μL终止反应;使用含有十二烷基磺酸钠(SDS)的10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离反应体系中的蛋白;电泳结束后,干燥凝胶,放射性自显影,使用紫外线胶成像仪扫描胶片上显示的磷酸化mAChR2和β2-AR蛋白带^〔4〕。

在磷酸化反应体系中分别加入0.1 μmo l/L的Gβγ,0.1 mmo l/L的氨甲酰胆碱,10 μmol/L阿托品,1 μmol/L肝素,最终反应体积30 μL。

在β2- AR的磷酸化反应体系中分别加入0.1 μmol/L的Gβγ,0.1 mmol/L的氨甲酰胆碱,1 mmol/L特布他林,1 μmol/L肝素,最终反应体积30 μL。

大鼠脑组织中分离纯化得到mAChR2,其相对分子量约为68 000 Da。猪脑中分离纯化得到G蛋白βγ亚基,其中Gβ相对分子量约为36 000 Da,Gγ相对分子量约为10 000 Da。

图 1

注: 1.正常对照; 2.氨甲酰胆碱; 3.Gβγ 图 1 Gβγ和氨甲酰胆碱对mAChR2磷酸化影响

结果表明Gβγ可以明显增强mAChR2的磷酸化,作为mAChR2激动剂的氨甲酰胆碱同样增强mAChR2的磷酸化。布他林可以增强β2-AR的磷酸化,而肝素(GRK2抑制剂)完全阻断了mAChR2的磷酸化。

图 2

注： 1.正常对照; 2.氨甲酰胆碱; 3.阿托品; 4.肝素。 图 2 氨甲酰胆碱、阿托品、肝素对GRK2 介导的mAChR 2磷酸化影响

结果表明,氨甲酰胆碱明显增强mAChR2的磷酸化, 阿托品或肝素( GRK2抑制剂) 完全阻断了mAChR2的磷酸 化。

图 3

注: 1.正常对照; 2.氨甲酰胆碱; 3.Gβγ。 图 3 Gβγ和氨甲酰胆碱对β2- AR受体磷酸化影响

结果表明,Gβγ可以增强β2- AR磷酸化,而氨甲酰胆碱不影 响β2- AR的磷酸化。

图 4

注: 1.正常对照; 2.特布他林; 3.肝素。 图 4 特布他林和肝素对GRK2介导的β2- AR 受体磷酸化的影响

特布他林可以增强β2- AR 的磷酸化,而肝素( GRK2 抑制剂) 完全阻断了mAChR2的磷酸化。

本研究结果表明,Gβγ在无激动剂存在的情况下能够明显增强mAChR2、β2-AR的磷酸化,同时氨甲酰胆碱明显增强β2-AR的磷酸化。mAChR2和β2-AR的磷酸化是依赖 mAChR2激活剂(氨甲酰胆碱)和β2-AR激活剂(特布他林)作用发生的。Gβγ在无激动剂存在的情况下同时增强 mAChR2和β2-AR磷酸化的作用结果,表明Gβγ通过作用到G蛋白偶联受体激酶、上调G蛋白偶联受体激酶活性增强了mAChR2和β2-AR磷酸化。G蛋白偶联受体家族的快速脱敏主要是由于受体的磷酸化,G蛋白偶联受体激酶特异性作用于激动剂或激活受体使受体磷酸化。表明Gβγ同Gα一样均可引起效应蛋白的激活,在细胞信号转导中起同样重要作用,共同介导一系列的生物学效应。