再生障碍性贫血(简称再障)是血液系统较难治的出血性疾病之一。有研究表明,其发病机制可能与长期接触化学毒物如苯、砷剂等,或服用氯霉素、磺胺类、非甾体类抗炎药物,或因电离辐射损害、病毒感染、免疫功能紊乱等因素直接相关^{〔1, 2, 3〕}。本研究模拟临床继发性再生障碍性贫血的发生机制建立苯诱发再障小鼠模型,并对其外周血液及骨髓有核细胞数和血清可溶性白细胞介素-2(sIL-2)、肿瘤坏死因子- α(TNF-α)变化进行检测,观察苯诱发再障对小鼠免疫功能的影响。

8~10周龄清洁级B alb/c小鼠40只(北京维通利华实验动物技术公司),雌雄各半,体重18~21 g,未曾交配,饲养于清洁级标准环境中(温度25#,湿度60%)。

苯(分析纯,国药集团化学试剂沈阳有限公司);玉米油(色拉级,金龙鱼有限公司);sIL-2、TNF-α检测试剂盒(美国ADL公司);2010型全自动酶标仪(奥地利 Anthos公司);C412多孔离心机(法国JOUAN公司);H E-MAVET950FS型全自动五分类血液分析仪(美国DREW公司);生物显微镜(日本OLYM PUS公司)。

将小鼠随机分为2组,正常对照组及再障模型组,每组20只。雌雄各半,分笼饲养。造模方法参照文献^〔4〕,造模成功判定标准参照文献^〔5〕,再障模型组给苯剂量为1 mL/(kg·bw),每日1次,连注14 d。

各组小鼠于14 d后,禁食24 h取材。取眶静脉血50μL与乙二胺四乙酸二钾盐(EDTA-K2)抗凝剂混匀,用于检测外周血象。摘取小鼠右侧眼球,取小鼠静脉血 0.5~0.7 mL,离心分离血清用于sIL-2、TNF-α检测。按照文献^〔4〕38方法取股骨,计数有核细胞。

(1)一般情况观察:称取胸腺、脾脏重量和体重,以胸腺或脾重量[M g/(10 g·bw)〕表示胸腺或脾指数。 (2)血象检测:采用全自动五分类血液分析仪检测小鼠白细胞(W BC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT)数量。(3)骨髓有核细胞计数(BMNC):参照白细胞计数法^〔6〕,计数每根股骨有核细胞数。(4) sIL-2、TNF-α指标检测:应用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法,按照试剂盒说明书操作,采用酶标仪测定各样品中的OD450值,通过标准曲线计算出样品中slL-2、TNF-α含量。

应用SPSS 11.0统计软件进行t检验和单因素方差分析。

2.1 小鼠一般情况

再障模型组小鼠多次注射苯以后,体重逐渐下降,精神状态渐显不佳,皮毛枯槁散乱、光泽度降低,部分小鼠有脱毛及皮损,造模14 d后死亡5只。解剖此组小鼠脏器,发现腹腔脏器略显苍白,脾脏及胸腺体积缩小,体重、脾指数和胸腺指数分别为(21.37±3.84) g,(21.74±3.69),(0.87±0.24) m g/(10 g·bw),与正常对照组的(29.57±2.43) g,(60.84±3.43),(3.43±1.02) mg/(10 g·bw)比较均有所下降,差异均有统计学意义(P < 0.01)。

表 1

表 1 各组小鼠外周血液及骨髓有核细胞数变化(x±s)

表 1 各组小鼠外周血液及骨髓有核细胞数变化(x±s)

与正常对照组比较,再障模型组小鼠的红细胞、血红蛋白、白细胞、血小板计数均明显下降,差异有统汁学意义(P < 0.01);同时,再障模型组小鼠骨髓增生低下,骨髓有核细胞数下降明显,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P < 0.01)。

再障模型组小鼠sIL-2含量为(107.24±9.96) pg/mL,与正常对照组的(38.84±3.88) pg/mL比较明显升高,差异有统计学意义(P < 0.01);再障模型组 TNF-α含量为(47.26±17.45) pg/mL,较正常对照组的(45.34 ±13.54) pg/mL略升高,但差异无统计学意义(P > 0.05)。

苯及其代谢产物对造血系统的毒性作用是通过产生大量氧自由基和损伤DNA,诱导造血干细胞凋亡和坏死以及基因突变和染色体改变而实现^〔7〕。近年研究认为,机体免疫调节机制紊乱在再障发病机制中起至关重要的作用^{〔8, 9〕},再生障碍性贫血患者的外周血及骨髓中常可检测到各种异常升高或降低的细胞因子^{〔10, 11〕}。本研究结果表明,再障模型组小鼠一般情况、血细胞计数等均有较明显变化,符合再障模型标准。同时,本研究中苯诱导再障模型小鼠也存在细胞因子分泌的异常,与文献^〔9〕报道一致。