近年来,氯胺酮(ketam ine,KET)在中国青少年中滥用呈快速上升趋势^〔1〕。目前,KET及其代谢物的分析检测主要依赖仪器联用技术,有关KET的免疫学检测方法也有报道^{〔2, 3〕}。KET代谢的半衰期为3~4 h,摄入体内由细胞色素酶P450经N去甲基作用形成去甲基氯胺酮(norke tam ine,NKET)和去氢去甲基氯胺酮(dehydrono rketam ine,DHNK),这些代谢产物在生物检材中含量比较高^〔4〕,因此,建立KET代谢物(主要是NKET)的检测技术更为重要。本研究采用 NKET完全抗原(NKET-多聚赖氨酸)免疫BALB/C小鼠,建立分泌单抗的杂交瘤细胞株,为免疫检测方法的建立提供基础依据。

2440/2-2 CO₂培养箱(美国SHELLAB公司);M IR-153恒温培养箱(日本SANYO公司);MK 3酶标仪(芬兰Labsy stem s Dragon W ellscan公司);DIAPHOT 300倒置显微镜(日本Nikou公司);TDL-4 B水平式离心机(上海安亭公司);SW-CJ-1超净工作台(上海锦屏公司)。去甲氯胺酮完全抗原(本研究室合成);去甲氯胺酮、氯胺酮标准品、多聚赖氨酸(PLL)、弗氏完全、不完全佐剂(美国Sigm a公司);四甲基联苯胺(TMB)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG (北京博奥森有限公司);经传代并经8-氮杂鸟嘌呤处理的小鼠骨髓瘤细胞系Sp 2/0(中国科学院上海实验动物中心)。

6周龄健康雄性Balb/c小鼠6只(中国科学院上海实验动物中心),体重18~22 g。

将300 μg去甲氯胺酮-多聚赖氨酸(NKET-PLL)完全抗原用与等体积完全弗氏佐剂充分乳化后腹腔接种Bakb/C小鼠进行首免疫。2周后,以150 μg NKET-PLL与等体积不完全弗氏佐剂混合乳化后尾静脉注射进行第2次加强免疫。此后每隔2周进行一次加强免疫。最后一次免疫采用脾内注射,4 d后取脾按常规方法进行细胞融合^〔6〕。

采用固相抗原间接竞争ELISA法^〔5〕进行杂交瘤筛选。以NKET牛血清白蛋白(BSA)为包被抗原,以免疫小鼠的血清为阳性对照,以SP-2/0骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照。阳性细胞孔的判定标准为(A试验 -A空白)/(A对照-A空白)> 2.1。对分泌阳性抗体的细胞进行克隆。采用有限稀释法,将阳性克隆细胞吹匀,取一微滴至培养瓶内,倒置显微镜下准确计数细胞个数,稀释为70个/mL再取1 mL稀释20倍,接种入96孔培养板中进行亚克隆。直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止。

采用动物体内诱生腹水制备mAb。取10~13周龄BALB/C小鼠腹腔注射液体石蜡,0.3~0.5 mL/只,8~10 d后,腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞,5×10⁵细胞/只。5 d后注意观察,收集腹水,离心去除沉淀,经饱和硫酸铵沉淀法^〔6〕纯化后,加甘油于 -20℃保存。

(1)效价测定:按照常规间接EL ISA法测定抗体的效价。(2)特异性测定:采用间接ELISA方阵滴定法确定抗原抗体的工作浓度,然后在工作浓度下采用间接竞争ELISA法对去甲氯胺酮、氯胺酮、苯丙胺、吗啡、苯巴比妥等作出抑制率曲线,以抑制率达到 50%时所对应的浓度为各自的半数抑制浓度(IC₅₀),然后计算交叉反应率。交叉反应率(%)=NKET的IC₅₀/NKET结构类似物的IC₅₀(3)亲和力测定:采用间接ELISA法^〔7〕测定 M cAb与包板抗原间的亲和常数K(L/mo l)。(4)亚类鉴定:采用mAb亚类鉴定试剂盒进行亚型鉴定。

免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合率为70%,最终选出1株分泌阳性抗体的杂交瘤细胞。对已建立杂交瘤细胞株进行观察,在传代后5~7 d内均能持续地增殖。在长达3个月的体外连续扩增传代过程中,未见细胞上清液中抗体效价下降。冻存3个月复苏后,杂交瘤细胞株仍保持着抗体分泌功能的89%。因此,可以认为建立的1株淋巴细胞杂交瘤株是稳定的。

以对照0 μg/L NKET标准品的吸光度值为A₀,不同浓度NKET标准品(0,50,100,200,400,800 μg/L)对应的吸光值为A,以A/A₀为纵坐标,标准品浓度的对数值为横坐标,绘制NKET抑制率曲线,根据回归方程计算NKET半数抑制率IC₅₀为181.9 μg/L。最低检出限 (10%抑制率对应的浓度)为25.1 μg/L。

(1)效价测定:本实验选择 6只健康ba lb/c小鼠,进行动物体内诱生制备mAb,每只小鼠可获得15~30 mL腹水。采用饱和硫酸铵法纯化腹水,经测定抗体效价为300 000。(2)特异性测定:所得mAb与NKET结构类似物KET的交叉反应率为34.6%,与另外几种类似物苯丙胺、吗啡、苯巴比妥等的交叉反应率均< 5%。(3)亲和力测定:所得mAb的亲和常数为2.96×10⁸ L/mo l。(5)亚类鉴定:mAb的亚类类型为IgG_2a。

由于氯胺酮代谢的半衰期较短,吸食体内后能较快代谢成去甲基氯胺酮,而传统仪器分析方法样品前处理较费时,有些方法的灵敏度又不高,所以检测氯胺酮结果易出现假阴性。因此,本研究通过制备抗去甲氯胺酮的特异单抗,并对其生物学特性等进行研究,为该特异性单抗在去甲氯胺酮ELISA试剂盒和胶体金试纸条中的应用打下基础。由于去甲氯胺酮为小分子化合物,无免疫原性,必须与载体蛋白共价偶联后才能制备出抗去甲氯胺酮的抗体。本研究采用前期合成的去甲氯胺酮完全抗原通过动物免疫、细胞融合、筛选、克隆和腹水制备,获得1株抗去甲氯胺酮的特异性单抗。间接竞争ELISA法表明,对去甲氯胺酮IC₅₀为181.9 μg/L,除与氯胺酮有交叉反应外,与其他类似物基本无交叉反应,表明所制备的单克隆抗体对去甲氯胺酮特异性较高,可用于研制高质量的ELISA试剂盒和胶体金试纸条。