三氯乙烯(trichloroethylene,TCE)是目前常用有机溶剂之一。研究发现,TCE可使雄性大鼠精子受精能力下降^〔1〕,在大鼠附睾和输精管内,形成TCE活性代谢产物并与蛋白质共价结合^〔2〕。TCE明显改变与生精过程和精子成熟有关酶的活力,而且使生精细胞减少,精子成熟障碍^〔3〕;TCE还使睾酮生物合成过程障碍^〔4〕。本研究选择雄性大鼠染毒TCE,检测其对睾丸细胞凋亡、c-myc和p53表达的影响,以进一步了解TCE生殖毒性,为TCE职业危害的防治提供科学依据。

TCE (分析纯,纯度≥99%),Trizol试剂盒 (美国GibcoBRL公司);M-MLV、RNase抑制剂、Oligo (dt)和 Taq聚合酶(北京Promega生物技术公司);dNTP (上海申友生物工程有限公司)。FACS流式细胞仪(美国BD公司);PCR 仪(德国Biometra TGRADIENT公司)。

睾丸经70%乙醇4 ℃固定24 h~,制备单细胞悬液进行细胞凋亡检测。应用相应CellQuest软件进行处理,以亚G₁峰的细胞占观察细胞总数的百分率为细胞凋亡检测指标。根据DNA含量计算细胞增殖指数(PI),PI= 〔S+G₂/M〕/〔G₀/G₁+S+G₂/M〕。

取睾丸组织50~100 mg加 1 mL Trizol充分匀浆,提取RNA,进行RT-PCR。引物合成,cmyc: 上游引物5′-AAC TTA CAA TCT GCG AGC CA-3′,下游引物5′-AGC AGC TCG AAT TTC TTC CAG ATA T-3′,扩增片段342 bp;p 53:上游引物5′-TTC CCT CAA TAA GCT GTT CTG CC-3′,下游引物5′-TGC TCT CTT TGC ACT CCC TGG-3′,扩增片段538 bp;β-actin内参照:上游引物5′-GAG ACC TTC AAG ACC CCA GCC-3′,下游引物5′-TCG GGG CAT CGG AAC CGC TCA-3′,扩增片段404 bp。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳,用BiocaptMV软件分析条带积分吸光度(A)值,计算出cmyc 、p 53与β-actin吸光度值的比值。

应用SPSS 10.0软件进行分析,组间比较采用方差分析和χ²检验。

表 1

表 1 不同组别大鼠睾丸细胞凋亡和细胞增殖指数(x±s, n= 5)

表 1 不同组别大鼠睾丸细胞凋亡和细胞增殖指数(x±s, n= 5)

三氯乙烯染毒后引起大鼠睾丸细胞凋亡率明显增高(P < 0.01)而细胞增殖指数则明显下降(P < 0.05),表明三氯乙烯不仅诱导睾丸细胞的凋亡而且抑制睾丸细胞增殖。

表 2

表 2 不同组别大鼠睾丸细胞c-myc和p 53表达(x±s, n = 5)

表 2 不同组别大鼠睾丸细胞c-myc和p 53表达(x±s, n = 5)

三氯乙烯染毒后,大鼠睾丸细胞c-myc mRNA和p 53 mRNA表达较对照组明显增高(P < 0.01),表明三氯乙烯使大鼠睾丸细胞c-myc和p 53表达增强。

细胞凋亡在生精过程中发挥十分重要作用。生理上通过生精细胞凋亡来维持精子发生过程动态平衡,维持成熟精子在数量上稳态,是睾丸发挥正常生理功能的必要条件。毒理上生殖细胞凋亡是导致少精和无精的重要机制之一。本研究发现,睾丸细胞凋亡增加而增殖指数下降,结合黄海雄的研究结果^{〔5, 6〕},表明TCE影响了生精过程,并使精子质量下降。

研究表明,TCE染毒小鼠,肝细胞中c-myc和c-jun的表达明显增强而且表达产物C-myc和C-jun蛋白也增多^〔7〕。 TCE也使人类肺癌细胞中的p53和Bax蛋白增加而Bc-l2蛋白则减少^〔8〕。c-myc为即刻早期表达基因,其表达产物c-Myc 为核内转录因子,参与调控细胞生长、增殖和分化以及凋亡^〔9〕,p 53也参与细胞凋亡^〔10〕。但在TCE诱导睾丸细胞凋亡过程中,c-myc和p 53表达增强与凋亡关系还需进一步探讨。