隐孢子虫病(cryptosporidiosis)是人体最常见的6种重要感染性疾病之一,可导致人体严重腹泻。WHO和美国疾病预防控制中心已将该病列为全球新发传染性疾病。近年研究显示,隐孢子虫感染在发展中国家占腹泻人群感染率的4%~20%,在发达国家也达0.6%~10%。隐孢子虫病目前在中国亦是一种流行较严重的食源性寄生虫病。目前对隐孢子虫感染与免疫、致病机制以及引起流行的因素等仍不十分清楚,并且针对该病仍无特效药物。本实验采用补骨脂和双氢青蒿素抑杀虫体,调控宿主机体对隐孢子虫感染与免疫应答反应过程,以期为隐孢子虫感染(病)的免疫防治提供新途径。

昆明种小鼠60只,雌雄各半,体重28~32 g (大连医科大学实验动物中心)。连续3 d粪检均无隐孢子虫卵囊排出。

地塞米松磷酸钠注射液(批号: 0705121,5 mg/mL,泗水希尔康制药有限公司);补骨脂(市售中草药,自制水煎剂,20 g/100 mL),双氢青蒿素粉剂(陕西森弗生物技术有限责任公司)。四氯乙烯(PE)标记的抗小鼠 CD 28流式细胞术试剂盒(美国eBioscience公司)。

(1)造模:采取腹股沟皮下注射地塞米松磷酸钠注射液的方法,剂量为0.05 mL (浓度5 mg/mL),每周2次,同时采用改良抗酸染色法观察小鼠粪便中是否出现隐孢子虫卵囊。4周后,小鼠粪便中均有卵囊出现,标志造模成功。(2)实验分组:将60只小鼠随机分成10组(每组6只,雌雄各半):A 1组:正常对照组,每日灌服1次蒸馏水,连续1 周;B 1组:模型对照组,造模结束后,每日灌服1次蒸馏水,连续1周;C 1组:补骨脂治疗组;造模结束后,每日灌服1次补骨脂,连续1周;D 1组:双氢青蒿素治疗组,造模结束后,每日灌服1次青蒿素,连续1周;E 1组:补骨脂与双氢青蒿素合剂治疗组,每日灌服1次合剂,连续1周;A 2,B 2,C 2,D 2,E 2与上述分组处理相同.只是治疗时间为2周。(3)实验用药:蒸馏水为0􀀂5 mL/只;自制补骨脂的浓度为20%(3.4 g/ kg),0.5 mL/只;双氢青蒿素剂量60 mg/kg,0.5 mL/只;合剂组为补骨脂与双氢青蒿素剂量各半,灌胃前混合,0.5 mL/只。 以上各药物均每日一次。(4)实验观察:每日进行一般观察 (毛色、摄食、活动、体重和寿命等)。1周后每组随机取出3 只雌性和3只雄性小鼠,摘眼球取血,乙二胺四乙酸2钠 (EDTK)抗凝,4 ℃冷藏,采用流式细胞术,在12 h内测定外周血中T细胞表面CD 28分子的表达情况;同时,将小鼠断颈处死,取十二指肠与空肠交界处约1 cm的小肠组织进行病理学观察。中药治疗2周后,重复上述方法留取小鼠相应待测定的标本。

外周血T 细胞表面的CD 28分子的流式细胞术检测;小鼠摘眼球取血 100 μL,加入适量EDTA抗凝;加入PE标记CD 28分子的单克隆抗体,混匀,室濡避光孵育30 min;加入2 mL红细胞裂解液,样品颠倒4次;室温避光孵育8 min;离心、洗涤后,应用射门法在BD流式细胞仪上观察CD 28分子的阳性细胞数,并计算CD 28⁺T淋巴细胞的比值。

采用SPSS 16.0统计软件进行各组间单因素方差分析。

表 1

表 1 隐孢子虫病鼠外周血CD 28表达水平及 粪检卵囊的变化(n= 6, x±s)

表 1 隐孢子虫病鼠外周血CD 28表达水平及 粪检卵囊的变化(n= 6, x±s)

正常对照组:精神状态和食欲良好,活动频繁,毛发有光泽。阳性对照组:精神不振,食欲和活动减少,毛发逆立,出现腹泻甚至死亡。药物治疗组:活动日趋频繁,食欲增加,死亡数量下降。 经过1和2周的治疗,所有药物治疗组小鼠的粪便卵囊量与阳性对照组比较,均明显减少(P < 0.05),而且合剂治疗组明显低于单剂治疗组(P < 0.05)。随着治疗时间的延长,药物治疗组C 2、D 2的排卵囊量分别低于C 1、D 1(P < 0.05)。双氢青蒿素治疗组D 1、D 2排卵囊量分别明显低于补骨脂治疗组C 1、C 2(P < 0.05)。

1周治疗中,A 1组:小肠上皮细胞清晰,腺体完整且细胞排列整齐;B 1组:上皮有缺损样改变,肠黏膜组织及腺体内见有许多坏死灶,同时,见有大量炎性细胞和淋巴细胞浸润;C 1组:肠黏膜组织可见坏死灶,腺体排列较整齐,回肠充血,固有层有大量的炎症细胞浸润;D 1组:肠黏膜少量坏死,出现的坏死区域变小或减少;E 1组:肠黏膜组织修复逐渐完整,坏死灶少见。2周治疗中,A 2组:回肠绒毛结构正常,上皮细胞完好;B 2组:上皮细胞缺损,细胞排列不整,空肠部分肠黏膜已脱落呈火山口状;C 2组:黏膜细织坏死恢复,腺体排列整齐;D 2组:黏膜恢复较好,上皮排列整齐;E 2组:上皮细胞完好,恢复较好。

1周组中,阳性对照组B1小鼠外周血T细胞表面的CD 28分子表达水平明显低于正常对照组A 1(P < 0.05),所有治疗组CD 28分子表达水平明显高于阳性对照组(P < 0.05)。2周组中,阳性对照组B 2仍明显低于正常对照组A2(P < 0.05),所有治疗组C 2、D 2、E 2的CD 28分子表达明显高于阳性对照组B 2 (P < 0.05),补骨脂治疗组C 2表达水平明显高于双氢青蒿素治疗组D 2(P < 0.05),补骨脂治疗组C 2和合剂治疗组E 2的表达水平均明显高于正常对照组A 2(P < 0.05)。2周阳性对照组B 2的表达水平明显低于1周阳性对照组B 1(P < 0.05),2周治疗组C 2、D 2、E 2的表达明显高于1周组C 1、 D 1、E 1(P < 0.05)。

本实验研究通过对隐孢子虫感染小鼠中药治疗前后体质变化、卵囊排出量以及肠壁黏膜组织病理变化动态观察,发现中药补骨脂、双氢青蒿素以及二者合剂组对隐孢子虫病的治疗效果令人满意。在抑杀虫效果方面,合剂治疗组优于单剂治疗组;双氢青蒿素组优于补骨脂组;2周组优于1周组,表明较长时间的稳定持续治疗明显有助感染控制及免疫应答反应能力的提高。由此可见这两种中药对隐孢子虫的感染和治疗有较为明显的疗效,而且二者具有协同抑杀虫体、提高机体免疫力,以抵御隐孢子虫感染与致病的作用。

在机体抵抗隐孢子虫的过程中,CD 4⁺T细胞介导的免疫反应起主导作用^〔1〕。CD 28广泛参与了T细胞的各种反应^{〔2, 3〕}。本研究检测了小鼠外周血T细胞的CD 28分子表达水平,发现补骨脂治疗组的表达量在治疗1周就表现出优越性,其表达水平显著高于正常对照组。2周后,补骨脂治疗组的表达水平已经高于双氢青蒿素治疗组,而且补骨脂单剂与补骨脂、双氢青蒿素合剂两组的表达水平明显高于正常对照。 通过上述结果,可以认为中药补骨脂能提高隐孢子虫感染小鼠外周T细胞表达共刺激分子CD 28的水平,通过激活T细胞活化阈值,调节Th 1/Th 2分化、诱导抗凋亡基因表达,增加细胞因子分泌,促进免疫突触形成,抑杀虫体,以增强机体的抵御隐孢子虫感染及致病的能力。同时,补骨脂治疗组在治疗后1~2周时间内,隐孢子虫卵囊排出减少和肠壁黏膜组织病变修复亦可证明其通过提高宿主机体免疫力,达到治疗感染的目的。而且治疗组中的CD 28分子水平的上调,小鼠处于良好的恢复之中,或许可通过测定小鼠外周的CD 28分子来间接观测药物的疗效。实验中还发现阳性对照组小鼠的 CD 28分子表达水平低于相应的正常对照,其原因可能与隐孢子虫对机体免疫系统的某些抑制作用相关。