促细菌生长物质是一类通过直接或间接作用于细菌生长代谢过程而加速细菌生长速度或为细菌生长所必需物质的总称。已有报道促细菌生长物质主要有稀土元素、微生物成分、 藻类成分、植物成分、动物成分和其他营养物质等^{〔1, 2, 3, 4, 5〕},这些物质可用于细菌的快速检测,特别是一些常见菌和生长较慢的细菌,如肠道菌、结核杆菌等,若能加速其在培养基中的生长速度,则会缩短检测时间,达到快速防治的目的。本研究采用大肠埃希菌为对象,筛选对大肠埃希菌有较好促生长作用的物质,并通过大肠埃希菌的生长速度和数量确定其最佳作用浓度,利用电镜观察其对细菌生长形态的影响,筛选出酵母提取物和海带水提液具有较好促大肠埃希菌生长的作用。现报告如下。

(1)菌株:大肠埃希菌(E.coli) K-12(1.359 CG-MCC)(中国科学院微生物研究所)。(2)培养基^〔6〕:普通肉汤培养基:蛋白胨10 g,牛肉粉3 g,NaCl 5 g,蒸馏水1 000 mL,Na₂CO₃调pH=7.4。固体肉汤培养基在普通肉汤培养基的基础上加入15%的琼脂。(3)试剂与仪器:微量元素类(镁,钴,锌,铁,铜;mmol/L)(天津市天大化工试验厂),浓度范围 (0.000 1~1);稀土元素类:La (NO₃)₃(单一稀土;mmol/L)、Ce (NO₃)₃(单一稀土;mmol/L)、硝酸稀土(38%)(混合稀土; g/L)、氯化稀土(45%)(混合稀土;g/L)(河南省商丘市稀土微肥示范厂),浓度范围分别为:(0.1~0.9、0.1~0.9、0.02~ 0.4、0.002~0.01);藻类提取物:褐藻酸多糖(%)(军事医学科学院二所),浓度范围(1~4);真菌提取物:酵母提取物 (%)(英国UNIPATH有限公司),浓度范围(0.5~10);马勃,茯苓,灵芝水提液(g/L)(天津大仁堂),浓度范围(2~20); 锇酸(美国TEDIA公司)。UV8500紫外分光光度计(上海天美公司);台式离心机(上海安亭科学仪器厂);CM120透射电子显微镜(荷兰Philips公司)。

待筛选物质分别经高压灭菌或G6 漏斗过滤除菌后制成储备液,用时直接加入已高压灭菌的液体培养基中。

各待筛选物质培养基分别为在普通肉汤培养基中加入不同量的待筛选物质组成的不同浓度培养基,加菌在37%恒温箱连续培养12 h,每浓度设2个平行管,重复2 次;对照组加入相同体积的蒸馏水。使用紫外分光光度计 UV8500对加入菌液培养后的培养基进行波长扫描,在波长为 420 nm时有最大吸收峰,每间隔1 h分别测量各培养基吸光度(A)值,观察各物质对细菌生长的影响。加菌培养后的A 值与培养基原有A值之差即为表示生长细菌的A值。选择具有细菌生长繁殖作用效果的物质作进一步重复试验,并进行细菌平板计数,多次重复结果一致后,计算各物质培养基生长后菌落均数,与未加促生长物质培养基比较后得出结果。

吸取1 mL菌液加入9 mL磷酸盐缓冲液(PBS)中,涡旋震荡器混匀,再吸取1 mL稀释液重复上述过程n次,即得10ⁿ倍稀释液,吸取该液1 mL,采用平板倾注法,在37%恒温箱连续培养24 h后计数菌落数;每个平板控制菌落数在30~300个左右;每次设3个平行板,重复2次。

在迟滞期、对数期、平台期分别收集菌液,1 000 r/m in,低速离心10 min,弃去培养基,加3%戊二醛固定液(1/15 mol/L PBS,pH=7.4)0.5 mL,于4%下固定2 h;1%锇酸(0.24 mol/L PBS,pH=7.4),4%固定后用乙醇、丙酮脱水,包埋切片。CM 120透射电子显微镜(80 000 V电压)观察放大8 000及17 000倍时各期细菌生长形态及大小。

表 1

表 1 待筛选物质对菌液A值的影响

表 1 待筛选物质对菌液A值的影响

表 1可见,各物质筛选浓度范围及在最适宜生长浓度时与对照组比较结果 (使菌液A值增加的最大倍数)显示,有促菌生长作用(A值增加倍数> 1)的物质La(NO₃)₃、Ce(NO₃)₃、酵母提取液、褐藻酸多糖、海藻水提液、海带水提液等。

以平板计数法筛选效果较明显的代表物质。结果显示,稀土元素La(NO₃)₃在细菌生长的对数期和平台期分别使菌落数增加,高于对照组 1.50倍和1.55倍;酵母提取物分别高于对照组2.11倍和 5.70倍;海藻水提液分别为2.11倍和3.42倍;海带水提液分别为3.78倍和3.90倍。

图 1

图 1 菌液A值的时间变化曲线

图 2

图 2 细菌平板计数的时间变化

选取促生长作用较强的酵母提取物及海带水提液,与对照组同时连续测量细菌A 值以及进行平板计数,重复5次后,绘制出各组细菌的生长曲线。结果显示,两者的最佳作用浓度分别为20 g/L和2%。 海带水提液和酵母提取物A值分别高于对照组的2.93倍和 5.06倍;平板计数高于对照3.94倍和5.39倍。表明2者有较好的促大肠埃希菌生长作用。

表 2

表 2 细菌生长各期分裂相比例及菌体直径(x±s)

表 2 细菌生长各期分裂相比例及菌体直径(x±s)

根据大肠埃希菌在添加不同物质后的对数生长曲线,分别选取0.5,3,10 h 为迟滞期、对数期和平台期。随机选取视野,在8 000放大倍数下,计数3个视野(约300个细菌)中分裂相细菌的百分比; 在17 000放大倍数下测量20个细菌的直径大小,取其平均值。

图 3

注: A: 对照组; B: 海带水提液组; C: 酵母提取物组 图 3 对数期各组细菌生长形态和外膜泡( ↑ ) ( 17 000 × )

电镜观察显示,与对照组比较,酵母提取物及海带水提液作用下,细菌对数期的类核(nucleoid)形状更不规则和松散,且胞质电子密度略高,海带水提液组出现外膜泡(outermembranevesicle)。

本研究结果显示,海带水提液和酵母提取物在一定浓度下可以促进大肠埃希菌生长。但不同的物质对大肠埃希菌生长促进作用不同的生长阶段具有不同的促进特征。

通过对大肠埃希菌迟滞期、对数期和平台期各组的细菌生长形态进行观察,8 000放大倍数下计数细菌分裂相比例。 发现在迟滞期,实验组与对照组的分裂相百分比较接近;对数期,实验组分裂相百分比迅速增高且2组均与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.01),酵母提取物组尤为明显;平台期,实验组分裂相百分比明显下降。菌体直径方面,在迟滞期实验组菌体已开始变大,海带水提液组与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.05);酵母提取物组与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.01);在对数期,实验组菌体直径均高于对照组,且2组与对照组比较差异均有统计学意义(P < 0.01),而酵母提取物组菌体直径略小,可能是由于分裂相百分比较大造成菌体相对较小;在平台期,海带水提液组菌体直径仍高于对照组,且差异有统计学意义(P < 0.05)。相比之下,对照组在分裂相百分比和菌体大小方面的变化都较平缓。可以看出,海带水提液和酵母提取物均可使细菌分裂相百分比和菌体直径增加,酵母提取物似乎更能促进大肠埃希菌分裂,海带水提液似乎更能使大肠埃希菌直径增大。