代谢综合征(metabolic syndrome,M S)是一组以代谢紊乱为特征的临床症候群,由M S引发的全球糖尿病以及心脑血管疾病的流行,已引起学者重视。研究表明,M S患病率在不同种族和不同地区间有明显差异^{〔1, 2, 3〕},但确切的病因和发病机制尚未完全明了。脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL) 是脂质代谢的关键酶之一,而且LPL基因多态性与M S各组分发生相关,但是结论尚不一致,可能存在种族与地区之间的差异^{〔4, 5, 6, 7〕}。本研究于2008年4月对200例哈萨克族M S患者和201名非M S居民进行病例对照研究,旨在探讨脂蛋白脂酶H indⅢ、S447X基因多态性与新疆哈萨克族M S的关系,为进一步揭示M S病因和病理生理机制提供理论依据。

采用分层整群抽样方法抽取1 444名新疆博乐地区和沙湾县≥18岁哈萨克族居民进行MS现况调查,按 2005年国际糖尿病联盟(IDF)对M S的定义^〔8〕从筛查出的 M S患者中随机抽取200例作为病例组,并从同一人群按成组匹配方法随机抽取201名非M S作为对照组。M S组男、女性分别为112和88例,对照组分别为121和80人,2组性别差异无统计学意义(χ²=0.726,P=0.394)。M S组年龄(50.07±11.59)与对照组年龄(48.23±12.04)差异无统计学意义 (P=0.12)。

(1)问卷调查:采用自编问卷进行自填式调查。 内容包括人口学资料、疾病史、心脑血管病家族史、吸烟和饮酒史、膳食、运动情况等;(2)体格检查:采用统一的标准方法测量研究对象的坐位血压〔收缩压(SBP)、舒张压(DBP),1 mmH g=0.133 kPa〕、身高、体重、腰围(WC)、臀围(HC)。 (3)实验室检查:包括空腹血清总胆固醇(TC)、甘油三酯 (TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C)和血糖(FPG)等。

三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)、 Taq酶(含MgCl₂)、10×PCR Buffer (北京天根生物有限公司);HindⅢ内切酶(大连宝生物工程有限公司);M nlI内切酶(美国NEB公司);引物(大连宝生物工程有限公司合成)。

取研究对象空腹静脉血200 μL,采用酚 -氯仿法提取血液基因组DNA,所有抽提的DNA均经0.7% 凝胶电泳验证,用紫外分光光度计进行纯度和定量测定后,置于-80℃保存备用。

PCR扩增所使用的引物参照文献〔5, 9〕。 HindⅢ:上游5′-AGA TGC TAC CTG GAT AAT CAA AG-3′,下游5′-AAT TTG TCA ATC CTA ACT TAG AG-3′; S447X:上游5′- TAC ACT AGC AAT GTC TAG CTG A-3′,下游5′-TCA GCT TTA GCC CAG AAT GC-3′。PCR反应终体积50 μL:基因组DNA 5.0 μL (约100 ng)、引物(10 pmo l/μL)各2.0 μL、dNTPs 4.0 μL (2.5 mmo l/L)、Taq酶(含Mg²⁺,2.5 U/μL)1.0 μL,10( PCR Buffer 5.0 μL。PCR循环条件均为:94)预变性5 m in,然后进行94)变性45 s、56)复性45 s、72℃延伸1 m in,共 35个循环,最后72℃延伸10 m in。PCR加样操作均在冰浴上进行,每次实验均进行阴性对照。取PCR产物6 μL和6× Loading Buffer 1~2 μL进行2%琼脂糖凝胶电泳(100 V,28 m in),Go ldenview染色后,用Bio-Rad凝胶成像系统拍照。

取HindⅢ PCR扩增产物15 μL加HindⅢ限制性内切酶1 μL (15 U/μL),10×M Buffer 2 μL,补ddH₂O至20 μL,37℃水浴4~12 h;取S447X PCR扩增产物15 μL加Mnl I限制性内切酶0.5 μL (5 U/μL),NEBuffer 2.0 μL,100(牛血清白蛋白(BSA)0.2 μL,补ddH₂O至20 μL,37)水浴4~ 12 h,然后65℃灭活20 m in以终止反应。水浴结束后取酶切产物10 μL和10(Load ing Buffer 1~2 μL上样后经2.5%琼脂糖凝胶电泳40 m in (100 V),然后在Bio-Rad凝胶成像系统上拍照并判断酶切基因型。

采用Epidata 3.0.2软件建立数据库,用双录入方法进行数据输入和逻辑检错;使用SPSS 16.0统计软件包进行χ²检验、t检验等。对不服从正态分布的空腹血糖采用lg (X)转换后再进行统计分析,表中数值均用x±s表示。 等位基因采用直接计数法。

图 1

注:M:BIOTEKETM 600 bp DNA 标记；1，2:H-H-基因型；3，4:H+H-基因型；5，6:H+H+基因型。 图 1 HindⅢ酶切位点 PCR-RFLP 检测结果

图 2

注:M:BIOTEKETM 600 bp DNA 标记；1，2:XX基因型；3，4:SX基因型；5，6:SS基因型。 图 2 S447X酶切位点的 PCR-RFLP 检测结果

HindⅢ多态性位点位于内含子8,是碱基T^→G突变所引起的,根据突变后 HindⅢ酶切位点是否存在,将T和G等位基因分别称为H+ 和H-等位基因。HindⅢ扩增产物长度为229 bp,经HindⅢ 限制性内切酶水解后出现3种基因型:无突变(H+H+)型 (139,90 bp);突变杂合子(H+H-)型(229,139,90 bp);突变纯合子(H-H-)型(229 bp)。本研究中检测到的H-H -基因型较少,故在分析时与H+H-合并,统称为H+H-/ H-H-基因型。S447X多态性位点位于第9外显子1595碱基处,单碱基C+G突变使TCA变为TGA,产生一个提前的终止密码子,导致翻译生成截短的蛋白质在C末端缺少了2个氨基酸序列Ser和Gly。根据其是否突变分为非突变的S等位基因和突变的X等位基因。S447X扩增产物长度为488 bp,经MnlI限制性内切酶水解后出现3种基因型:无突变 (SS)型(285,203 bp);突变杂合子(SX)型(285,248,203,37 bp);突变纯合子(XX)型(248,203,37 bp)。本研究只检测到 XX型5例,其中对照组4例,MS组1例。故在分析时,将XX 基因型与SX基因型合并,统称为SX/XX基因型。

表 1

表 1 不同组别居民HindⅢ 、S447X 基因型和等位基因频率比较

表 1 不同组别居民HindⅢ 、S447X 基因型和等位基因频率比较

LPL基因HindⅢ、S447X基因型在总体样本及2组中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡。

表 2

表 2 MS各组分测定值与HindⅢ 、S447X 基因型关系(x±s)

表 2 MS各组分测定值与HindⅢ 、S447X 基因型关系(x±s)

表 3

表 3 MS组分异常个数与HindⅢ 、S447X基因多态性关系

表 3 MS组分异常个数与HindⅢ 、S447X基因多态性关系

结果表明,MS各组分在HindⅢ、S447X不同基因型间差异均有统计学意义(P < 0.05),并随着M S组分异常的增多,H+H +、SS基因型的携带率有相应增加趋势。

本研究采用病例对照成组匹配设计方法分析HindⅢ和 S447X多态性与M S的关系,2组之间性别、年龄均衡。PCR-RFLP结果表明,对照组H-和X等位基因频率分别为 28.60%和12.44%,与文献报道相近^{〔10, 11〕}。危险度评价分析表明,携带H-或X等位基因的个体患MS的危险性分别是携带H+或S等位基因的0.704倍和0.410倍,因此推测H-等位基因和X等位基因可能是M S的保护因素。

M S的严重程度与M S各组分及其异常个数的多少密切相关。本结果表明,随着M S组分异常数目的增多,H+H+、 SS基因型的携带率有不断增加趋势。H+H-/H-H-基因型携带者和SX/XX基因型携带者的WC、SBP、DBP、TG、FPG 水平分别低于H+H+基因型携带者和SS基因型携带者,HDL-C水平高于后者,与文献结果一致^{〔4, 9, 12, 13〕}。因此推测在哈萨克族人群中H+H-/H-H-基因型和SX/XX基因型可能对M S的各组分同样产生影响,从而影响M S的发生发展。

M S是多种因素共同作用的结果,但具体发病机制尚不清楚。目前针对LPL基因HindⅢ和S447X多态性与M S关系的研究相对较少,HindⅢ、S447X多态性与M S的关系及环境因素、生活行为因素是否产生交互作用,均需进行大样本、多民族、多地区的深入研究,以进一步证实LPL基因HindⅢ和 S447X多态性与MS的关系。