化疗是肝癌综合治疗的重要手段,但肝癌细胞对化疗药物的多药耐药常导致化疗失败,因此,多药耐药已成为肝癌治疗的主要障碍^〔1〕。肿瘤耐药机制是多因素、多途径共同作用的过程,其中P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)高表达被认为是介导肿瘤多药耐药最主要机制之一^〔2〕。有研究表明,P-gp表达阳性的肿瘤细胞对化疗不敏感,而P-gp表达阴性的肿瘤细胞对化疗敏感^〔3〕。为了解原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中多药耐药基因P-gp的表达情况及其影响因素,本研究通过免疫组织化学法检测HCC患者P-gp的表达情况,以寻找化疗疗效的预测指标,为预防肝癌的复发和转移提供参考依据。

收集2008年9月-2009年8月在广州市2家三级甲等医院进行原发性肝癌手术的肝细胞癌患者135例。将手术切除的肝癌组织经10%的中性福尔马林固定、脱水、常规石蜡包埋后,连续切片5张,片厚4μm,进行常规苏木素伊红(HE)染色和免疫组织化学染色。

鼠抗人P-gp单克隆抗体、免疫组织化学S-P试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色剂(北京中杉生物技术有限公司)。

采用免疫组化S-P二步法,用0.01mol/L pH6.0的柠檬酸盐缓冲液进行高压抗原修复,用已知P-gp阳性片作为阳性对照,磷酸盐缓冲液(PBS)代替第一抗体作为阴性对照。P-gp阳性表达主要位于细胞膜。判断标准^〔4〕:按阳性细胞百分率分,阳性细胞0%为0分、≤10%为1分、11%~50%为2分、51%~80%为3分、>80%为4分;按阳性细胞着色强度分,无色为0分、浅黄色为1分、黄色为2分、棕黄色为3分;将阳性细胞百分率和着色强度的得分相乘,得分≤2分为P-gp阴性,>2分为P-gp阳性。所有切片的免疫组化结果均读片>2次。

采用EpiData 3.1建立数据库,应用SPSS 15.0统计软件进行χ²检验、Spearman相关分析和多因素非条件Logistic回归分析。

共收集135例HCC患者,其中男性118例,女性17例;年龄19~83岁,平均(49.39 ± 11.9)岁。肝癌患者HBsAg阳性121例,占89.63%,HBsAg阴性14例,占10.37%。按肝癌的临床病理分级,高分化36例,占26.67%;中分化74例,占54.81%;低分化25例,占18.52%。有吸烟史66例,占48.89%;无吸烟史69例,占51.11%;有饮酒史48例,占35.56%;无饮酒史87例,占64.44%。

图 1

图 1 P-gp在原发性肝细胞癌中的阳性表达（S-P，400×）

图 2

图 2 P-gp在原发性肝细胞癌中的阴性表达（S-P，400×）

135例HCC患者中,P-gp表达阳性109例,表达阳性率为80.74%;P-gp表达阴性26例,表达阴性率为19.26%。P-gp在HCC患者的阳性表达主要位于细胞膜和细胞浆,表现为黄色,细胞核则无表达。

表 1

表 1 不同临床特征HCC患者P-gp表达阳性率比较

表 1 不同临床特征HCC患者P-gp表达阳性率比较

HCC患者P-gp表达阳性率在不同年龄、肿瘤直径大小间差异有统计学意义(P < 0.05);低分化HCC患者中P-gp表达阳性率高于中、高分化HCC患者(P < 0.05);相关分析结果显示,肿瘤细胞分化程度越低,P-gp表达阳性率越高(r=0.25,P=0.003);血清甲胎蛋白(AFP)升高患者P-gp表达阳性率高于AFP正常患者(P < 0.01);谷草转氨酶(AST)升高患者P-gp表达阳性率高于AST正常患者(P < 0.01)。

表 2

表 2 P-gp阳性表达多因素Logistic回归分析

表 2 P-gp阳性表达多因素Logistic回归分析

以P-gp表达阳性作为因变量,将单因素分析中差异有统计学意义的年龄、肿瘤直径大小、肿瘤分化程度、血清AFP水平、AST水平5个因素为自变量,进行多因素非条件Logistic回归分析。结果显示,肿瘤细胞分化程度低、血清AFP水平升高和AST水平升高是P-gp表达阳性的危险因素。

P-gp是一种跨膜糖蛋白,其作用机制是在细胞膜上形成ATP依赖性膜泵,当抗肿瘤药物进入时,将药物泵出细胞,使细胞内药物浓度降低,导致细胞耐药^〔5〕。本研究结果显示,HCC患者中多药耐药基因P-gp表达阳性率为80.74%,低分化HCC患者中P-gp表达阳性率高于中、高分化肝癌患者,与蒋业贵等^〔6〕研究结果一致,与临床上HCC分化程度越低,恶性程度越高,预后越差,对化疗不敏感,易产生耐药性相符。

本研究中肝癌细胞分化程度、血清AFP水平和AST水平是P-gp表达阳性的主要危险因素。血清AFP水平作为HCC的相对特异性标志物,其变化对HCC的早期诊断和治疗具有重要作用^〔7〕,AFP值的增高可以提示HCC的进展^〔8〕,即肝癌P-gp表达阳性与其临床病理特征、病情发展有关。因此,可通过监测多药耐药基因P-gp的表达来判断病情发展,以指导临床合理用药,提高化疗疗效,延长患者生存期。