结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CT-GF)是转化生长因子-β(transforming growth factor-beta,TGF-β)的下游介质,具有明显的有丝分裂原性和趋化性^〔1〕。近年研究发现,CTGF表达水平在纤维化组织中表达上调并且促进其发展,并且与伤口的愈合,肿瘤发生、进展、转移及预后密切相关^〔2〕。有研究表明,CTGF表达水平与糖尿病肾病的发生发展有关^〔3〕,CTGF参与建立正常的胰岛内分泌细胞的比例和结构^〔4〕。本研究运用实时定量PCR及免疫组织化学技术对食管癌患者的癌组织和癌旁正常食管组织的CTGF表达水平进行测定,结合患者的性别、家族史、浸润深度、肿瘤大小、淋巴结转移、分化程度等资料,分析在食管癌浸润和转移过程中CTGF的生物学功能,研究食管癌患者预后的相关影响因素。

选取2004-2007年郑州大学第一附属医院和河南省林州市肿瘤医院就医的食管癌患者作为研究对象,采集手术后患者食管癌原发病灶及其匹配的正常食管组织有效标本186对。肿瘤标本和匹配的正常组织标本均通过组织学诊断,以同时具有食管癌原发病灶及配对正常食管组织标本作为有效标本。标本离体后立即放在液氮罐中,然后转移到-80℃冰箱中冷冻保存。收集患者的性别、家族史、浸润深度、肿瘤大小、淋巴结转移、分化程度等资料。

荧光定量PCR系统(Bio-Rad,Hercules,CA);TRIzol试剂(美国Invitrogen公司);鸟类成髓细胞白血病病毒(AMV)逆转录系统(美国Promega公司);荧光定量PCR试剂盒(德国Roche诊断有限公司);兔抗人CTGF(美国凯米考恩国际有限公司);辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(美国凯米考恩国际有限公司)。

使用TRIzol试剂盒从食管癌标本中提取完整的RNA,通过1%的琼脂糖凝胶电泳及RNA的吸光度(A)值评估RNA含量和纯度。用SuPerscriPtⅡ试剂50μL将2μgRNA逆转录成cDNA。

理论基础是参数循环阈值(Cycle threshold,Ct),是指产生的荧光量超过一个固定阈值时的循环次数,mRNA的表达水平以Ct值表示。通过制作标准曲线对实验进行质量控制,用内参基因β-actin对RNA含量的变异进行较正。

(1)实时荧光定量PCR:将cDNA1:20稀释后作为PCR模板,反应体积为15μL,做熔解曲线和琼脂凝胶电泳分析扩增结果,熔解曲线有特异的产物峰,并且电泳图中有产物片段。(2)免疫组织化学染色法:取食管癌组织和癌旁正常食管组织,严格按照试剂盒说明书进行操作,收集16μm厚的切片,进行免疫组化侧群(SP)染色。每一标本在200倍显微镜下观察3个染色最强的视野,记数阳性细胞数,并计算阳性细胞百分比。每个患者的食管癌组织中阳性细胞百分比与匹配正常食管组织中阳性细胞百分比比值作为食管癌蛋白表达水平指标。

应用SPSS 12.0软件,扩增倍数取以2为底对数转换后,经正态性检验数据呈正态分布,采用配对t检验、两样本t检验、方差分析和χ²检验进行统计分析;采用Kaplan-Meier法进行单因素生存分析,绘制患者的生存曲线,并进行时序检验。采用Cox回归对CTGF表达和参数进行多因素分析。以α=0.05作为检验水准。

与正常食管组织比较,CTGF mRNA和蛋白在食管癌组织中的表达上调。单因素分析表明,食管癌组织CTGF mRNA的表达(5.29 ± 5.12)明显高于正常食管组织(8.63 ± 5.12)(t=10.112,P=0.0000),食管癌组织CTGF蛋白表达(20.83 ± 8.20)明显高于正常食管组织(4.52 ± 4.53)(t=23.820,P=0.0000)。

CTGF mRNA的表达水平、CT-GF蛋白的表达水平、性别、家族史、浸润深度、肿瘤大小、淋巴结转移、分化程度与患者的生存率相关。CTGF mRNA表达水平高的患者生存率低于CTGF mRNA表达水平低的患者(P=0.0000),CTGF蛋白表达水平高的患者生存率低于CTGF蛋白表达水平低的患者(P=0.0000);男性患者生存率明显低于女性(P=0.0104),有肿瘤家族史患者的生存率低于无肿瘤家族史者(P=0.0017),浸润深度深的患者生存率低于浸润深度浅的患者(P=0.0012),肿瘤大的患者生存率低于肿瘤小的患者(P=0.0381),淋巴结转移者生存率低于无淋巴结转移者(P=0.0000),分化程度高的患者生存率低于分化程度低的患者(P=0.0010)。患者的年龄、病理类型、肿瘤位置与生存率无关。

表 1

表 1 食管癌患者CTGF表达和临床病理参数的多因素生存分析

表 1 食管癌患者CTGF表达和临床病理参数的多因素生存分析

食管癌患者生存率的独立危险影响因素为CTGF mRNA的表达水平、CTGF蛋白的表达水平、性别、家族史、淋巴结转移、分化程度。未发现年龄、浸润深度、肿瘤大小、病理类型和肿瘤位置与食管癌患者的生存率有明显相关性。

CTGF是即刻早期基因CCN家族成员之一,是一种多功能的细胞因子。近年来,随着对CTGF结构和生物学功能研究的深入,CTGF在器官纤维化中的作用逐渐引起注意^〔5〕。

目前研究发现,CTGF在乳腺癌、黑色素瘤、肉瘤中过度表达,在急性淋巴细胞白血病和小儿纤维母细胞癌中也高表达。基因芯片研究发现,CTGF与脑胶质瘤的进展有关,在最恶性的脑肿瘤中有较高的星形细胞瘤水平^〔6〕,但以往的研究中对食管癌中CTGF的表达研究较少。本研究结果表明,食管癌组织中CTGF的高表达可能影响食管癌患者术后的生存,其可作为食管癌患者预后的一个评价指标,并可能成为基因治疗的一个作用靶点。单因素生存分析显示,CTGF mRNA的表达水平、CTGF蛋白的表达水平、性别、家族史、浸润深度、肿瘤大小、淋巴结转移、分化程度与患者的生存率有关,这些均与国内以往的研究相符^{〔7, 8〕}。食管癌组织中CTGF mRNA及蛋白低表达的患者预后较好,其生存期明显高于高表达者,与Zirn等^〔9〕的研究结果一致。因此,对切除食管癌组织标本中CTGF mRNA检测,一定程度上可以反映肿瘤的恶性程度,作为判断食管癌发展程度和评估患者预后的指标,具有一定的应用前景。

Cox回归分析结果显示,危险因素CTGF mRNA的表达水平、CTGF蛋白的表达水平、淋巴结转移与食管癌患者的生存率有明显相关性,与陈萍萍等^〔10〕的研究结果一致。性别和分化程度与食管癌患者的生存率呈明显相关性,与谢东等^〔6〕对脑胶质瘤的研究结果相似。本研究还观察到家族史与食管癌患者的生存率呈明显相关,其具体机制有待进一步研究。以上因素均可以作为判断食管癌患者预后指标。CTGF的表达水平与食管癌的发生、发展及转移有着密切的关系,有望成为基因诊断、基因治疗及预后的有效靶标。若能进行CCN家族基因的检测,对预测食管癌病人术后复发转移以及指导治疗有实际意义。