有研究表明,砷可以引起机体内砷致机体脂质过氧化的产生及抗氧化能力降低,从而造成机体的氧化损伤^{〔1, 2〕}。而肝脏是砷主要累及的靶组织^〔3〕,但砷对肝细胞的作用特点研究较少。研究提示,活性氧(ROS)和线粒体膜电位(ΔΨm)在细胞凋亡中发挥着重要作用^{〔4, 5〕}。为了进一步探讨砷对肝细胞的凋亡作用机制,本研究采用流式细胞仪检测细胞凋亡率和胞浆中ROS、ΔΨm水平,并探讨ROS和ΔΨm在NaAsO₂诱导L-02肝细胞凋亡过程中的作用。

(1)材料:人肝细胞株(L-02)细胞(中科院上海细胞库);RPM I1640培养液(美国Gibco公司);优级胎牛血清(天津灏阳生物制品有限公司);NaAsO₂、罗丹明123、双氢罗丹明123(美国Sigma公司);二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶1:250(美国Amresco公司);Annexin V-F ITC细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物技术研究所);其他试剂均为国产分析纯。主要仪器:BD FACSArray流式细胞仪(美国BD公司);TE2000-U+DXM1200倒置显微镜(日本尼康公司)、 MCO-15AC CO2培养箱(日本Sanyo公司);M ILL I-Q超纯水器(美国Millipore公司)。(2)细胞培养与给药方式:细胞在含10%胎牛血清的RPM I1640培养基,5% CO₂、37℃条件下培养,选择对数生长期细胞进行实验。实验组加入NaAsO₂使其终浓度分别为50,100,150μmol/L,给药24 h后收获细胞。(3)细胞凋亡检测:Annexin V-FITC染色流式细胞仪检测细胞凋亡。(4)胞内活性氧水平检测:不同浓度NaAsO₂作用24 h后,磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗,加入双氢罗丹明123使其终浓度为2μmol/L,37℃避光3 h后收集细胞,PBS重悬细胞,流式细胞仪检测。(5)胞内线粒体膜电位水平检测:前述方法处理细胞后,加入罗丹明123使其终浓度为2μg/mL,37 ℃避光30 min,PBS重悬细胞,流式细胞仪检测。(6)统计分析:采用SPSS 16.0软件进行统计分析,组间差异采用t检验。

NaAsO₂对L-02肝细胞ROSΔΨm和细胞凋亡影响(表 1):由表 1可知,与对照比较,ROS生成量明显增高,除50μmol/L NaAsO₂组之外,100、150μmol/L NaAsO₂差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01);组间差异亦有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01);与对照比较,50,100,150 μmol/L NaAsO₂组的ΔΨm随剂量的增加而明显降低,差异有统计学意义(P %lt; 0.01),呈剂量-反应关系,组间差异亦有统计学意义(P < 0.01)。

表 1

表 1 NaAsO2 对L - 02肝细胞ROS、ΔΨm和 细胞凋亡的影响(n= 3, ± s )

表 1 NaAsO2 对L - 02肝细胞ROS、ΔΨm和 细胞凋亡的影响(n= 3, ± s )

本研究结果表明,NaAsO₂在较低浓度时即可引起L-02肝细胞ROS生成量增多和细胞凋亡率增加,ROS生成量、细胞凋亡率明显增高,差异有统计学意义(P < 0.05或 P < 0.01)。推测细胞在NaAsO₂的作用下可以诱发细胞内的脂质过氧化,引起ROS生成量的增加从而诱导细胞凋亡的发生,因此,ROS的堆积可能是NaAsO₂诱导L-02肝细胞发生凋亡的作用机制之一。NaAsO₂处理L-02肝细胞后ΔΨm随着染毒剂量的增大而明显下降,差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01),表明NaAsO₂引发的细胞凋亡与ΔΨm降低密切相关,而ΔΨm降低又与NaAsO₂诱导产生过多的ROS引起线粒体脂质过氧化密不可分。

本研究发现,ROS的堆积可以诱发ΔΨm降低和细胞发生凋亡,故推测^{〔6, 7, 8, 9〕}ROS诱导细胞凋亡的途径可能是通过 ROS的堆积导致线粒体膜发生脂质过氧化和结构功能受损,诱发线粒体的渗透性转运孔(MPTP)打开,使得水、各种离子成分和可溶性物进入线粒体,造成质子电化学梯度耗散,ΔΨm降低,引起核膜的破裂和蛋白质活性物质如细胞色素C (Cyto-c)、凋亡诱导因子(apop tosis-inducing factor,A IF)等的释放,继之Caspase瀑布式活化,最终导致细胞凋亡。NaAsO₂对L-02肝细胞凋亡机制是否引起Cyto-c、Caspase等发生改变,有待于进一步研究。