乳腺癌是女性最常见、最多发的恶性肿瘤,世界范围内乳腺癌的发病率和死亡率呈上升趋势^〔1〕。临床观察显示,河北省唐山地区乳腺癌病例有逐年增多且发病年龄年轻化的趋势。1976年唐山震后为了消毒防病,保护灾民身体健康,在唐山市区、郊区、东矿区及丰南县城施用了大量杀虫剂和消毒剂^〔2〕。而有机氯农药可长时间残留于环境中,造成环境持久性污染,具有干扰雌激素活性效应。研究显示,有机氯农药暴露可能与乳腺癌的发生有关联^{〔3, 4〕},乳腺癌的发生是环境因素和遗传因素相互作用的结果。为了解有机氯农药残留对唐山地区女性乳腺癌的影响,本研究采用1:1配对的病例对照方法,从环境与遗传因素相互作用的角度,探讨有机氯农药残留和谷胱甘肽转移酶M1(GSTM1)与乳腺癌发病的关系。

病例为2006年9月-2007年10月在唐山市5所大医院就诊的新发女性乳腺癌患者70例,所有病例均经病理学确诊为原发乳腺癌,并在唐山市本地居住>10年。排除标准:转移性乳腺癌患者、有精神疾患和临终患者。对照与病例同期收集,选取病例所在医院同期住院女性患者,按年龄相差不超过2岁、居住地区相近进行1:1配比,排除有职业暴露史、肿瘤、内分泌相关疾病、生殖系统疾病、乳腺相关疾病以及精神疾病病例。

采取面谈方式,由调查员填写自行设计的调查表。内容主要包括患者一般情况、既往病史及家族史、吸烟及饮酒史、饮食及生活习惯、生理生育史、环境暴露史等。

主要试剂:10×缓冲液、MgCl₂、三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs,包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP)、Taq聚合酶;溴化乙锭(EB)、电泳缓冲液(TBE)、PCR Marker、琼脂糖等(华美生物工程公司)。滴滴涕(DDT)和六六六(HCH)标准品(国家标准物质研究中心);无水硫酸钠(分析纯)、浓硫酸(分析纯)、正己烷;高速低温离心机、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像图像分析仪、-20℃低温冰箱等、GC-4000A型气相色谱仪(附⁶³N-iECD检测器,北京东西电子技术研究所)。

收集70对病例及对照的血液4mL,离心后取血清2mL,-20℃保存待测。采用食品中六六六、滴滴涕残留量的测定方法(GB/T5009.19-2003《食品中六六六、滴滴涕残留量的测定》),并适当改进。样品处理:0.1mL甲酸与0.5mL血清充分混匀,加入2.5mL正己烷充分振摇,超声波萃取10min,取上层有机层萃取液过无水硫酸钠脱水,用真空干燥器干燥,并用正己烷定容至2.5mL,然后加入0.2mL浓硫酸,静置30min磺化,取磺化后的萃取液1mL保存于-20℃待测^〔5〕。用气相色谱-电子捕获(GC-ECD)方法检测血清样品中DDT及HCH水平。

分别以对照血清中DDT/HCH含量的中位数作为划分依据,血清中总DDT>15.013μg/L为高残留组,总DDT≤15.013μg/L为低残留组;血清中总HCH>7.111μg/L为高残留组,总HCH≤7.111μg/L为低残留组。

抽取调查对象静脉血4mL,乙二酰四乙酸二钠(EDTA)抗凝,采用盐析法抽提DNA。GSTM1基因多态性检测采用PCR方法,构建GSTM1引物,引物序列上游:5'-AACTCCCTGAAAAGCTAAAGC-3';下游:5'-TTGGGCTCAAATATACGGTGG-3,PCR扩增片段长度为215bp;β-球蛋白(β-globin,268bp)作为内对照,引物序列上游:5'-AAGAGCCAAGGACAGGTAC-3',下游:5'-AACTTCATCCACGTTCAAC-3',由赛百盛生物技术有限公司合成。

总体积20μL;ddH₂O11μL;10×buffer2μL;dNTPs3.2μL;引物各1μL;Taq酶0.2μL(1U);模板1μL。各成分于冰浴中用微量加样器加入0.2mL离心管中,微量振荡器混匀,短暂离心后于PCR仪上进行扩增。

94℃预变性3min后,于94℃变性1min、58℃退火1min、72℃延伸1min为1个循环,进行3个循环,94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s为1个循环进行扩增,共进行30个循环,结束后于72℃最后1次延伸5min。限制性片段长度多态性(RFLP)分析:取2μL扩增产物,加少量上样缓冲液,120V电压条件下电泳15min,于凝胶成像系统下观察结果并照相。

GSTM1基因型为非缺失型时,扩增的基因片段存在,可获得215和268bp2个条带;当GSTM1为缺失型时,扩增的目的基因片段不存在,只出现内对照268bp1个条带。

用Excel 2003建立数据库,应用SAS 6.12软件,以χ²检验分析GSTM1基因多态性与乳腺癌的关系。运用条件Logistic回归模型分析有机氯农药在乳腺癌发生中的作用。根据Khoury等^〔6〕提出的2型交互作用模型(type 2 gene-environment interaction,GEI),分析GSTM1和有机氯农药在乳腺癌发生中的交互作用。模型中包括单独遗传因素、单独环境危险因素和2因素共同组成变量的效应。有无交互作用以及交互作用的强度与方式,由各变量前的回归系数β决定。G(Y)=α+β_eE+β_gG+β_egEG,式中Y是疾病的比值(odds),α为常数,协变量E为环境危险因素,协变量G为代谢基因多态性,EG为两者交互作用项,根据交互作用系数(γ=β_eg/β_e)判断交互作用存在与否以及基因-环境作用类型。判定依据1:OR_eg=OR_e × OR_g为相乘模型;OR_eg>OR_e × OR_g为超相乘模型;OR_eg<OR_e × OR_g为次相乘模型;OR_eg=OR_e+OR_g-1为相加模型。判定依据:r > 1,表示基因因素对环境暴露的效应有放大作用,正向交互作用;r < 1,表示基因因素对环境暴露的效应有减弱作用,负向交互作用;r=1,表示基因因素对环境暴露没有交互作用;当研究的环境因素是危险因素,此时β_e > 0,r为负值时,则表示基因因素有很强的保护作用。

病例组平均年龄(47.09 ± 10.36)岁。对照组平均年龄(46.59 ± 10.55)岁,差异无统计学意义(t=0.28,P=0.778)。病例组40~50岁年龄段发病人数最多,其次为35~40岁年龄段,<30岁也有乳腺癌病例,提示乳腺癌发病年龄年轻化的趋势。将病例组和对照组的职业、文化程度、婚姻状况进行均衡性比较差异均无统计学意义,具有可比性。

表 1

表 1 GSTM1基因多态性与乳腺癌发生的关系

表 1 GSTM1基因多态性与乳腺癌发生的关系

经Hardy-Weiberg(简称H-W)平衡定律检验,表明各基因频率分布不拒绝H-W遗传平衡的假设,具有群体代表性。以GSTM1是否缺失作为分类变量分析,经χ2检验,差异无统计学意义,显示GSTM1是否缺失与乳腺癌发病无关联。

多因素条件Logistic回归分析显示,血清中DDT和HCH高残留可增加乳腺癌发生的危险性,OR值分别为1.015,1.212;95%CI=0.997~1.033,95%CI=1.065~1.379。

表 2

表 2 GSTM1基因多态性与血清DDT残留量之间的交互作用

表 2 GSTM1基因多态性与血清DDT残留量之间的交互作用

此交互作用模型提示,GSTM1缺失基因型对血清DDT残留的效应有放大作用,表现为超相乘模型。

表 3

表 3 GSTM1基因多态性与血清HCH残留量之间的交互作用

表 3 GSTM1基因多态性与血清HCH残留量之间的交互作用

此交互作用模型提示,GSTM1缺失基因型对血清HCH残留效应有放大作用,表现为次相乘交互作用模型。

本研究提示,女性血清中总HCH和总DDT残留与乳腺癌存在着一定的关联性,HCH、DDT残留水平愈高,患乳腺癌的危险性愈高,与国外研究结果一致^{〔7, 8〕}。但Lopez-Carrillo等对墨西哥妇女的研究却未发现体内β-HCH水平与乳腺癌有关^〔9〕。由于研究的人群、国家不同,HCH的使用量也不相同,因此会存在一定的差异。中国曾是一个农药使用大国,累积使用HCH比同期国际上多3倍^〔10〕,因此,中国的研究更有意义。谷胱甘肽转移酶(GSTs)是体内重要的Ⅱ相解毒酶系,有研究发现,携带GSTM1缺失基因型的绝经前妇女患乳腺癌的风险性增加^〔11〕。但本研究未显示GSTM1缺失基因型与乳腺癌的发生有关联。应用交互作用系数(r)可探讨GSTM1基因多态性与有机氯农药之间的交互作用及其对乳腺癌发生的影响。本研究显示,GSTM1缺失基因型与DDT、HCH在乳腺癌发生过程中分别存在一定的交互作用,交互作用系数分别为1.237,1.379,交互作用分别表现为超相乘模型和次相乘模型。