中国公共卫生  2010, Vol. 26 Issue (5): 553-554   PDF    
引用本文
陈祖云, 戴佳琳, 黄江, 申萍香, 廖兴江. 抗亚洲带绦虫药物对乳酸脱氢酶抑制作用[J]. 中国公共卫生, 2010, 26(5): 553-554.
CHEN Zu-yun, DAI Jia-lin, HUANG Jiang, et al. Effect of praziquantel, albendazole and mebendazole on recombinant lactate dehydrogenase of Taenia asiatica[J]. Chinese Journal of Public Health, 2010, 26(5): 553-554.
抗亚洲带绦虫药物对乳酸脱氢酶抑制作用
陈祖云1, 戴佳琳2, 黄江2, 申萍香2, 廖兴江2    
1. 贵阳医学院药用植物学与生药学教研室, 贵阳550004;
2. 贵阳医学院多媒体形态学实验室
收稿日期: 2009-12-03.
基金项目: 国家自然科学基金(30760227);贵州省科技攻关项目(2008-3060);贵州省农业科技攻关项目〔黔科合NY字(2009-3074)〕;贵州省科技攻关项目(2009-3101);贵州省省长基金〔黔省专合字(2009)82号〕;贵阳市科技局社发攻关项目(2009-3005)
作者简介: 陈祖云(1960- ),男,贵州人,副教授,本科,研究方向:药用植物研究.
通讯作者: 黄江
摘要: 目的 探讨抗亚洲带绦虫药物对于重组的亚洲带绦虫乳酸脱氢酶(Ta.LDH)酶促功能的影响。方法 将不同浓度的吡喹酮、阿苯达唑和甲苯咪唑加入Ta.LDH所催化的丙酮酸还原成乳酸(正反应)以及乳酸氧化成丙酮酸(逆反应)的标准反应体系当中,测定烔酰胺腺嘌呤2核苷酸(NADH)在A340处吸光度的变化值。采用SPSS 16.0软件进行分析,计算药物对酶活性的相对抑制率。结果 与对照组比较,0.10 mmol/L吡喹酮对Ta.LDH催化正逆反应的相对抑制率分别为93.99%(P<0.01)和94.67%(P<0.01),0.10 mmol/L阿苯达唑分别为85.45%(P<0.01)和73.81%(P<0.01);0.15 mmol/L甲苯咪唑分别为92.2%(P<0.01)和86.13%(P<0.01)。结论 Ta.LDH可能为吡喹酮、阿苯达唑和甲苯咪唑抗亚洲带绦虫药物作用的靶标分子。
关键词: 亚洲带绦虫     乳酸脱氢酶     重组蛋白     吡喹酮     阿苯达唑     甲苯咪唑    
Effect of praziquantel, albendazole and mebendazole on recombinant lactate dehydrogenase of Taenia asiatica
CHEN Zu-yun, DAI Jia-lin, HUANG Jiang, et al    
Department of Medical Plant and Pharmacognosy, School of Pharmacolgy, Guiyang Medical College Guiyang 550004, China
Abstract: Objective To detect the effect of praziquantel,albendazole,and mebendazole on activity of the recom binat lactate dehyd rogenase of Taenia asiatica(rTaLDH).Methods The effects of praziquantel,a lbendazole,and mebendazole on the enzymatic activity of rTaLDH were detected by spectrophotometric method in standard reaction systemes tablished before.The solvent of each reagent was used as control.The results were analyzed with SPSS16 10 softw are.Results Compared with the control,considerab le inhibition for both reduction and oxidation reactions catalyzed by rTaLDH was observed at 0.10mmol/L of praziquantel(P<0.01).Compared with the control,the enzyme activities of rTaLDH for reduction and oxidation reactions were inhibited by 93.99% and 94.67%,respectively,at 0.1 mmol/L of praziquantel(P<0.01).At 0.15mmol/L of mebendazole,enzymatic activities were inhibited by 92.2% for reduction reaction and 86.13% for oxidation reac tion,respectively,lower than that of the control(P<0.01).Conclusion Praziquantel shows a high inhibition on rTaLDH.TaLDH may be one of the molecular targets of praziquantel,albendazole,and mebendazole.
Key words: Taeniaasiatica     lactate dehydrogenase     recom binant protein     praziquantel     albendazole     mebendazole    

吡喹酮和苯并咪唑衍生物对牛带绦虫、亚洲带绦虫和猪带绦虫等均有良好的杀虫效果,已成为治疗绦虫病的首选药物,并广泛应用。但这些药物杀虫的机制目前尚未完全明了,又无有效的替代药物,为应对未来可能出现的抗药性问题带来潜在的危机。已知亚洲带绦虫赖以生存的能量主要来源于糖酵解途径〔1〕。理论上,任何对亚洲带绦虫糖酵解途径关键酶起抑制作用的药物均可能具有抗亚洲带绦虫作用。乳酸脱氢酶(LDH)是糖酵解途径的末端酶,催化丙酮酸还原为乳酸及乳酸氧化为丙酮酸的可逆反应,其酶活性的抑制可阻断糖酵解代谢,影响能量的生成并可导致丙酮酸在寄生虫体内的聚积,甚至使虫体死亡。LDH可能是药物作用靶标之一,但无直接证据。本研究在获得亚洲带绦虫乳酸脱氢酶(TaLDH)全长cDNA序列、原核表达及纯化并对TaLDH进行酶学特性研究的基础上〔2, 3〕,进一步研究吡喹酮、阿苯达唑和甲苯咪唑对TaLDH活性的影响。

1 材料与方法 1.1 材料

按文献〔3〕方法获得纯化的重组Ta1LDH蛋白,所得蛋白浓度为1.0mg/mL。丙酮酸(pyruvate)、乳酸(lactate)、还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、氧化型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸酸(NAD+)、槟榔碱粉(arecoline)、吡喹酮、阿苯达唑(albendazole)及甲苯咪唑(mebendazole)(美国Sigma公司);吡喹酮(praziquantel)200mg/片(南京制药有限公司)。DU530型核酸/蛋白分析仪(美国Beckman公司);HS-100A恒温水浴控制器(上海万达科技器材服务部);微量移液器(美国Gilson公司)。

1.2 溶液配置

吡喹酮工作液的配置:取吡喹酮粉末溶于乙醇中,使其终浓度为100mmol/L,过滤备用,以等体积的乙醇液做为对照。阿苯达唑工作液的配置:取阿苯达唑粉末溶于二甲基亚砜(DMSO)中,使其终浓度为1mmol/L,过滤备用,以等体积的DMSO液做为对照。甲苯咪唑工作液的配置:取甲苯咪唑粉末溶于DMSO中,使其终浓度为0.1mmol/L,过滤备用,以等体积的DMSO溶液做为对照。

1.3 方法

Ta.LDH酶活性测定参考文献〔5〕方法,略有改动。Ta.LDH催化丙酮酸还原成乳酸的标准反应体系为:10mmol/L丙酮酸、0.5mmol/L二甲基亚砜(NADH)和100mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.0);Ta.LDH催化乳酸还原成丙酮酸的标准反应体系为:100mmol/L乳酸、1mmol/L NAD+和100mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH9.5)。在标准反应体系当中分别加入不同浓度的待测药物,使其终浓度分别为:吡喹酮(0.02,0.04,0.06,0.08,0.10mmol/L);阿苯达唑(0.01,0.02,0.04,0.06,0.08,0.10mmol/L);甲苯咪唑(0.02,0.04,0.06,0.08,0.10,0.15mmol/L)。然后加入重组的Ta.LDH启动催化反应,37℃反应1min,分光光度法测定340nm处吸光度(A)值,实验至少重复3次。对照组中分别加入等体积的溶剂,相同方法测定。

1.4 统计分析

采用SPSS 16.0统计软件进行分析。计算反应前后吸光度变化△A340、算术均数及标准差(x €± SE),并对同浓度药物组及对照组进行t检验;以空白组酶活性△A340 (x €± SE)为对照(100%)计算实验组的相对酶活性;计算各组酶活性的相对抑制率(%)并制图。

2 结 果 2.1 吡喹酮对重组 Ta1LDH酶活性影响 (图 1)
图 1 吡喹酮对重组Ta.LDH催化还原反应以及氧化反应的影响

各浓度梯度的吡喹酮对重组Ta.LDH所催化的丙酮酸还原成乳酸及乳酸氧化成丙酮酸正、逆反应均显示出明显的抑制趋势;与对照组比较,药物浓度在0.04mmol/L时酶催化正反应的活性被抑制42.02%(P < 0.01)。药物浓度在0.04mmol/L时酶催化逆反应的活性被抑制53.11%(P < 0.01);药物浓度在0.10mmol/L时酶催化正逆反应的活性分别被抑制93.99%(P < 0.01)和94.67%(P < 0.01)。

2.2 阿苯达唑对重组 Ta1LDH 酶活性的影响 (图 2)
图 2 图 2 阿苯达唑对重组Ta.LDH催化还原反应以及氧化反应的影响

与对照组比较,不同浓度的阿苯达唑对重组Ta.LDH催化的正、逆反应均表现出明显的抑制作用,且对正、逆反应影响趋势差异不大。药物浓度在0.10mmol/L时,对酶催化的正、逆反应的抑制分别为85.45%(P < 0.01)和73.81%(P < 0.01)。

2.3 甲苯咪唑对重组 Ta.LDH酶活性的影响

不同浓度的甲苯咪唑对重组的TaLDH催化的正、逆反应与对照组相比均表现出明显的抑制作用,在相同药物浓度下,对正反应的抑制作用均强于逆反应。药物浓度在0.06mmol/L时,对酶催化的正反应抑制作用为47.85%(P < 0.01),而对逆反应的抑制作用为30.39%(P < 0.01)。药物浓度在0.12mmol/L时,对酶催化的正反应抑制为92.2%(P < 0.01),而逆反应抑制为86.13%(P < 0.01)。

图 3 甲苯咪唑对重组Ta.LDH催化还原反应以及氧化反应的影响
3 讨 论

吡喹酮为广谱抗寄生虫药物,目前已成为治疗多种寄生吸虫、绦虫和线虫的首选药物之一〔4, 5〕,但其作用机制目前尚不完全清楚。本研究以不同浓度的吡喹酮对纯化的LDH活性影响进行试验。结果表明,吡喹酮对重组的TaLDH催化的正、逆反应均有抑制作用。与对照组比较,药物终浓度为0.1mmol/L时,吡喹酮对重组的TaLDH催化的正逆反应的酶活性分别抑制93.99%和94.67%。以上结果证实了吡喹酮对TaLDH有明显的抑制作用。结合TaLDH在虫体表膜的膜性表达,TaLDH功能受到抑制,体内的丙酮酸不能有效的转化成乳酸排出体外,导致虫体内酸度增高,虫体内环境稳态遭到破坏,而直接受影响的是虫体的表膜,这点与吡喹酮作用后虫体实验观察到的表膜结构遭到破坏一致。以上研究从分子水平证实吡喹酮对亚洲带绦虫LDH有明显抑制作用,TaLDH可能是吡喹酮作用的分子靶标之一,而两者相互作用以及对虫体的影响还需进一步的实验研究论证。

阿苯达唑和甲苯咪唑均属于苯并咪唑衍生物,本研究发现不同浓度的阿苯达唑和甲苯咪唑对于重组TaLDH催化丙酮酸还原成乳酸以及乳酸氧化为丙酮酸都存在着一定的抑制作用。阿苯达唑浓度在0.10mmol/L时,对酶催化的正、逆反应的抑制分别为85.45%和73.81%,甲苯咪唑浓度在浓度为0.15mmol/L时,对酶催化的正反应抑制为92.2%,而逆反应抑制为86.13%。

实验结果表明,吡喹酮和苯并咪唑类抗寄生虫药物可直接作用于TaLDH,均有较强的抑制作用;结合TaLDH的定位研究提示TaLDH可能是吡喹酮和苯并咪唑类作用的分子靶标。

参考文献
〔1〕 吴观陵.人体寄生虫学[M].3版.北京:人民卫生出版社,2005:347.
〔2〕 申萍香,黄艳,黄江,等.生物信息学分析亚洲带绦虫乳酸脱氢酶基因及其蛋白的结构与特性[J].中国人兽共患病杂志,2008,24(8):722-727.
〔3〕 黄江,胡旭初,吴璇,等.牛带绦虫亚洲亚种35 kD乳酸脱氢酶基因的克隆表达、及免疫原性分析[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2008,26(4):268-271.
〔4〕 Dando C,Schroeder ER,HunsakerLA,et al.The kinetic properties and sensitivities to inhibitors of lactate dehydrogenases(LDH1 and LDH2)from Toxoplasm a gondii:comparisons with pLDH from Plasmodium falci parum[J].Mol Biochem Parasit,2001,118:23-32.
〔5〕 马骏.吡喹酮治疗吸虫病的临床研究进展[J].中国寄生虫病防治杂志,2005,18(4):313-314.