随着工业化的发展,水源地及饮用水安全形势越来越严峻,严重威胁着居民的身体健康^〔1〕。传统的水质安全检测方法虽然有较高的精度和灵敏度,但检测步骤复杂,费时费力。 而且水体中的毒素成分繁多、复杂,很难实现同时检测多种毒物;一些生物学检测法能直接反应水质综合毒性,而且快速、 经济、准确、灵敏,为预警和控制水污染提供科学依据,因此得到了广泛的应用和迅速发展。现就当前主要水质综合毒性检测的生物学方法研究进展作一综述,以便为水质安全控制提供参考依据。

活体生物毒性法是利用水生生物对水环境中有毒化合物具有普遍的敏感性,根据其特殊的生理生化反应变化来判断水质综合污染状况。传统的活体生物毒性法常以鱼类、蚤类等多细胞生物为实验对象来检测水体的长期和综合毒性,但其灵敏度较低、所需时间长,不适于饮用水的快速安全评价^〔2〕。细菌和藻类等生物由于其单细胞特点,对毒物反应更灵敏,在评价毒物的毒性大小方面更具优势,在水质综合毒性快速检测中呈现出了良好的研究和应用前景。目前比较成熟的活体生物毒性检测法主要有藻类毒性试验和发光菌抑制试验。

低等藻类为单细胞,体积小、生命周期短,对外界环境条件的变化反应灵敏,而且易于分离,作为水质综合毒性的指示物具有很好的研究和应用价值。研究表明,水体中重金属和有机物污染能抑制藻类的光合作用、呼吸作用、酶的活性和生长^〔3〕。根据此原理,在水质监测工作中,在待测水样中加入适合的培养基,接种敏感藻类进行培养,将水样中毒物对藻类的抑制作用程度作为水体有毒物质综合毒性的评价标准。1981年,国际经合组织(OECD)制定了藻类生长抑制试验的国际标准方法来评价水质毒性;中国在《水和废水检测分析方法》中也规定了藻类生长抑制实验作为评价水质综合安全的标准。另外,也有许多实验证明了藻毒性实验在衡量水质综合毒性中的应用。如沈洛夫等^〔3〕利用藻类抑制实验研究水中有毒物对盐藻的毒性,在短时间内准确检测出3 种硝基芳烃类物质对盐藻的半数抑制效应浓度 ( EC₅₀ ) ,并由此判定硝基芳烃类物质的生物毒性,从而一定程度上评价水质的综合毒性。Giancarlo等^〔4〕用羊角月牙藻类监测意大利托斯卡纳区域大面积的水体,通过地表水和地下水中杀虫剂对藻类生长的影响来评价毒物对水体生态的危害性。

发光菌抑制法是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光细菌发光强度的影响,从而评价水体中毒物的有无和强度。此外,由于细菌与人体细胞对毒物的反应存在一定程度上的相似性,作为水质安全的指示物更具科学性,而且由于其单细胞的特点,反应时间会更短、更灵敏。 早在1981年,Beckman生物技术公司率先研制出基于发光菌抑制法原理的Microtox生物毒性测定仪,该仪器可在15 min 内快速检测水质综合毒性^〔2〕; 1995年,我国将这一方法列为环境水体毒性检测的标准方法(GB /T15441 - 1995) 。随后在此领域有许多相关研究以完善此方法。国内相关研究以发光菌为试验生物,测定了重金属以及多种常见的取代硝基苯类化合物对发光菌的单一及联合毒性,进而评价水体中普遍存在重金属与有机污染物的复合污染^〔5〕。Ren 等建立QSAR ( quantitative structure - activity relationship )模型测定了对发光菌发光强度抑制毒性的新方法,并用该方法成功地测定了水中98种有机化合物的单一和联合抑制毒性效应,结果与传统检测方法的一致性可达99% ,说明该法可用于水中有毒化合物的综合检测^〔6〕。宋晓青等^〔7〕应用微板毒性分析方法,研究5种不同类型除草剂(百草敌、磺草灵、西草净、除草定、环嗪酮)和4种重金属(镉、镍、钴和锌)混合物对淡水发光菌— 青海弧菌Q67的发光抑制作用。结果发现,上述毒物对青海弧菌Q67抑制作用明显,而且毒物之间具有加和作用。

藻类毒性实验和发光菌抑制实验的优势在于毒物对其作用具有非特异性,能够实现水体中毒物的综合高通量检测,而且由于选定的藻类和发光细菌本身没有危害性,传统的培养技术又很成熟,检测手段也相对简单,因此,在水质安全综合评价方面具有很大的研究和应用价值。

生物芯片是通过缩微技术,根据分子间特异性相互作用的原理,将生物分子(如基因探针、基因片断、抗原、抗体等) 固定于硅片、载玻片或高分子聚合物薄片等固相介质上形成的生物分子点阵。在待分析样品中的生物分子与生物芯片的探针分子发生杂交或相互作用后,利用精密扫描仪器等对杂交信号进行快速、并行、高效的检测,判断检测样品中靶分子的数量,从而达到分析检测的目的。生物芯片设计集成化,简化了分析过程,使检测速度加快,能同时检测水中多种有毒物。法国一家主要的水管理企业Lyonnaise des Eaux,开发出一种生物芯片以检测公共饮用水中的微生物,整个过程可在 4 h内完成且结果精确可靠,费用比常规方法低10倍。目前用于水质综合毒性检测的生物芯片技术主要为基因芯片技术和蛋白质芯片技术^〔8〕。

基因芯片是将大量的探针分子固定在载体上,根据碱基互补配对原理,与标记的样品分子发生杂交作用后检测杂交信号的强度及分布,从而获取样品分子的数量和序列分布等信息。Masafumi等^〔9〕已成功开发出一种快速检测食品中致病菌的微流芯片,这种方法灵敏度高且重现性好,整个检测过程仅需3 h,一次可同时检测4种常见致病菌。在水质安全检测中,该法主要用于水中有害微生物的测定。如杨喻晓等以PCR扩增致病菌特异性DNA片断,结合制备出含有11种不同致病菌特异性核苷酸探针的基因芯片,并应用于常见的食源性致病菌鉴定,检测灵敏度达620 cfu / g,且特异性高^〔10〕。通过冠状病毒同步检测与鉴别的基因芯片技术的建立发现该技术敏感性高、通量大、结果直观,可以同步检测样品中存在的多种冠状病毒,比传统PCR法敏感1 000 倍^〔11〕。基因芯片技术还能完成水中毒素的检测,如Call 等通过分析E. coli O157∶H7的Shiga样毒素Ⅰ、Ⅱ及溶血素 A,发现基因芯片可准确检测各种E. coli O57∶H7的分离物,其敏感性是凝胶电泳的32倍以上^〔12〕。

蛋白质芯片是通过自动化的点样系统将多种蛋白(抗原或抗体) ,高密度地结合在固相载体上,形成蛋白质的微阵列。在水质安全检测中,将水样中的有毒物质与其进行特异性结合所引起的信号改变通过适当的检测器完成对有毒物质进行定性、定量检测。蛋白质芯片既可用于水中致病微生物的检测,又适合于有毒化学物质的综合检测。Schleicher公司已发明了一种可同时进行大肠埃希菌和埃布菌检测的快速检测设备,根据蛋白质微阵列,利用荧光染色,可以对病菌进行定性和半定量的检测^〔13〕。Mauriz 等[14 - 15]利用表面等离子体子共振( surface p lasmon resonance,SPR)技术在20 min内快速检测水中西维因残留和毒死蜱,检测限分别为55和45 ng/L,与色谱法检测结果的一致性可达 99%。军事医学科学院已成功地对农药阿特拉津半抗原进行了衍生化,制做了检测小分子的污染物蛋白质微列阵,对其最低检测限为0. 001μg/mL^〔16〕;左小霞等^〔17〕采用双抗体夹心法原理进行免疫芯片技术的研究,实现了在同一张芯片上同时检测葡萄球菌肠毒素A、B,检测灵敏度达到1 ng/mL水平。

生物芯片技术操作简单、自动化程度高、高效、应用范围广,非常适合水体及其它食品中微生物和有毒化学物质的综合毒性检测。然而要更广泛地应用生物芯片技术检测水质安全,还需解决诸如建立标准化程序、降低检测费用、简化样品制备和标记操作、进一步提高检测的特异性等一系列问题。

基于生物传感器的检测技术被列为21世纪五大医学检验技术之一,是现代生物技术与物理学、化学等多学科、多领域相交叉和结合的产物,集富集、分离于一体。主要利用生物敏感元件(如酶、抗原、抗体、细胞等)与待测物质发生特异性反应(形成复合物、发色、发光等) ,产生的信息如光、电、热等被相应的信号转换器变为可定量和可处理的信号,从而换算出被测物质的量或浓度,具有选择性好、响应快、样品需要量少、可微型化、便携化、能现场检测的优点^〔18〕,是近年来水质安全快速检测的热点,是检测水质中有害物质最有效的新技术之一。

水中毒物能够非特异性地影响固定在电极表面的酶活性,酶生物传感器通过测定酶活性变化的程度,即可推算出样品中毒物的量。近年来,微电子技术、纳米材料制备技术、生物技术的发展促进了酶生物传感器在水质安全检测中的研究与应用。有研究表明,用一种基于ZnO纳米微阵列固定的酪氨酸酶生物传感器来测定水中酚类化合物的浓度,对水中甲酚、4 - 氯酚和苯酚的最低检测限分别为 0. 1,0. 25,和0. 2μmol/L,稳定性能也好,说明该方法能有效的检测出水中微量的有毒化合物^〔19〕。国外报道,用一种胆碱酯酶光纤生物传感器检测水中农药西维因和敌敌畏,检出范围分别为0. 11 ～8. 0 mg/L,5. 0 ～30 μg/L,检测限分别为 108,5. 2μg/L,回收率可达94. 9%^〔20〕。Tadeuszk等^〔21〕将脲酶包埋在pH敏感铱氧化电极表面的聚氧乙烯( PVC)膜上,通过抑制率来检测汞和其它重金属离子,发现该法对无机汞有检测范围可达0. 05～1. 0μmol/L。目前对水中农、兽药残留研究较多的传感器为乙酰胆碱酯酶类传感器,杨云惠^〔22〕研究一种安培型乙酰胆碱酯酶(AChE)生物传感器,并将其用于水中有机磷农药的测定,检测下限可达μmol/L;同时她还研制了一种基于纳米金技术的可更新的抑制型汞离子传感器,电极对环境中汞离子响应的线性范围为0. 09～1. 99μmol/L,检测下限为0. 08μmol/L。

利用环境中有毒化合物对细胞代谢过程产生影响,而这种干扰又可以引发一系列的化学变化,将微生物固定在电极上作为识别和感受元件组成传感器,能够非特异地检测水体和环境中多种有害物质。如Trang等^〔23〕用大肠埃希菌生物传感器检测水中的重金属,能达到世界贸易组织(WTO)所要求的检测下限且稳定性高。有研究表明,将对毒物敏感的发光菌作为感受元件,可以检测水中重金属、农药、多氯联苯、多环芳烃等有毒物质,检测限达1mg/L^〔24〕。目前的研究趋势则主要围绕如何更好地提高生物传感元件的敏感性方面。相关研究发现,将弧菌属细菌体内的一个操纵子在铜诱导启动子的控制下导入产碱杆菌属细菌中,从而使细菌在铜离子的诱导下发光,并将该细菌和光纤一起包埋在聚合物基质中制成的传感器可以检测水中重金属离子浓度,最低测量浓度可达到1 μmol/L,而且具有选择性好、测量范围广、储藏稳定性强的特点^〔25〕

生物传感技术在检测水质综合毒性方面具有很大的优势,尤其在大型活动期间的饮水安全监测中将发挥重要作用。 欧美一些发达国家非常重视水质综合毒性检测技术,如德国、 美国、荷兰、意大利及西班牙等将水质及环境样品综合毒性测试列入国家标准。该技术的核心是Microtox急性毒性测试技术,是一种基于生物传感技术的检测系统,已被很多国家用于检测大城市饮用供水系统,该传感器具有携带方便,检测时间短(20 min左右) 、检测范围广(近2 000种化合物)等优点,已成功应用于1996年亚特兰大奥运会、2000年美国民主党全国代表大会、美国五角大楼及20个洲、荷兰阿姆斯特丹等城市的供水系统。作为一种新的检测手段,生物传感器能够满足高通量、现场在线监测的需要,在水质综合毒性检测具有很大的应用和开发潜力。

综上所述,当今面临饮用水安全严峻形势,因此,研发高效、快速、高质量的水质毒性综合检测技术和有效的预警机制是保障饮水安全的迫切需求。生物传感器、生物芯片、活体生物毒性检测等技术和方法具有重要的研发价值和应用前景,将在未来水质安全监测和控制领域发挥更大的作用。