乳酸菌是一种重要的益生菌,也是发酵食品中最常用的发酵剂,其在人体内重要的生理功能已得到证实^{〔1, 2〕}。但是,乳酸菌的耐药性对人体有两方面影响:(1)耐药的益生菌可以避免人体服用抗生素造成菌体被杀灭,可用来调节服药期间产生的肠道菌群失衡;(2)乳酸菌可能成为耐药基因传播的中间宿主,这对于人类控制菌体耐药性的传播有不良影响。本研究重点观察酸奶中的乳酸菌对抗生素的敏感性,对乳酸菌携带的耐药基因进行检测,为探讨酸奶中益生菌是否在服药期间发挥作用及其可能存在的耐药基因转移提供基础依据。

菌株来自广州市内超市4个品牌的酸奶。PCR反应中的阳性对照来自携带Amp和Tet基因的质粒PBR322,纯水作为DNA阴性对照。

水解酪蛋白(MH)培养基、溶菌肉汤(LB)培养基、乳杆菌选择性(SL)培养基、链球菌选择性(TYC)培养基、链球菌基础(PY)培养基。培养基原料(广东环凯微生物科技有限公司)。配方及制作方法按文献〔3〕。

将酸奶样品用无菌水进行稀释107～109倍。各取稀释液250μL置于SL琼脂培养基平板和TYC琼脂培养基平板上,涂布。37℃培养,72h后,进行纯种的划线分离。纯化培养株进行革兰染色,镜检及生化培养测定。凡是革兰染色阳性,过氧化氢酶试验阴性的菌株初步确定为乳酸菌。在初步鉴定的基础上,进行硝酸盐还原试验、明胶液化试验、H2S产生实验和糖发酵试验区分鉴定。乳酸杆菌的生化特性测定方法及结果判断参照文献〔3〕。

采用纸片扩散法。测定乳酸菌对氨苄青霉素和四环素(北京药品生物制品检定所)的敏感性。试验时用标准的参考对照菌株与检测菌株平行测定,质量控制对照菌株为大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923和铜绿色假单胞ATCC27853。实验方法和结果判定参照文献^〔4〕。

将分离到的乳酸菌提取DNA作为模板^〔5〕。从Genebank下载氨苄青霉素和四环素的耐药基因,用PrimerPremier5.0生物软件设计其PCR扩增引物,所有引物均由上海英峻生物技术有限公司合成。用来扩增Tet(M)和Tet(W)基因的引物为tet-F5′2TRMTGSAWTCCACTTCS2CAACG23′,tet2B5′2GAYACGCCMGGMCAYATGGATTT23′,目标长度分为1160和928bp。扩增Amp的引物为:amp2F5′2GCAACTTTATCCGCCTCCAT23′和amp2B5′2CATTTCCGT2GTCGCCCTTAT23′,目标长度为631bp。PCR反应条件分别为:25μL反应体系:10×PCR缓冲液215μL,dNTP2μL,引物各2.5μL,无菌去离子水13μL,DNA模板2.5μL,0.2μLTaqDNA聚合酶5U/μL(大连宝生物生物工程公司)。用PCR扩增仪(美国BioRad公司)进行扩增。Amp扩增循环条件:裂解温度94℃5min。每个循环为94℃变性30s,55.0℃退火30s,72℃延伸1.5min,25个循环;最后延伸72℃7min。Tet扩增循环条件:裂解温度94℃5min。每个循环为94℃变性30s,52.3℃退火30s,72℃延伸115min,25个循环;最后延伸72℃7min。

以上PCR产物以110%琼脂凝胶,电泳缓冲液Tris-乙酸(TAE),81V,1～3h电泳。DNA分子量标准选用DNAMarkerDL2000(北京鼎国生物技术有限公司),电泳结束后用凝胶成像系统(美国BioRad公司)拍照分析。

在4种酸奶中分离鉴定出7株乳酸菌,其中保加利亚乳酸杆菌(B1)、嗜酸乳酸杆菌(A1)、干酪乳酸杆菌(C1)、鼠李糖乳酸杆菌(R1)各1株,嗜热链球菌3株(T1、T2、T3)。由生化特性测定结果可知,分离出的保加利亚乳酸杆菌和嗜酸乳酸杆菌不能发酵葡萄糖酸盐,为专性同型发酵种。而鼠李糖乳酸杆菌和干酪乳酸杆菌能发酵葡萄糖酸盐,为兼性异型发酵种。在4株乳酸杆菌中,只有鼠李糖乳酸杆菌能发酵鼠李糖产酸。

在分离的7株乳酸菌对2种抗生素的药敏性实验中,B1和T3对2种抗生素都敏感,R1和C1对2种抗生素均耐药;A1和T2对氨苄青霉素耐药,但对四环素则分别为中介和敏感;T1对氨苄青霉素敏感,对四环素为中介。4株菌对氨苄青霉素耐药率为57%;2株对四环素耐药率,为28%。可见,分离出的乳酸菌对2种抗生素产生了较高的耐药率。

由图 1可见,菌株A1,C1,R1,T1和T2Amp出现阳性,扩增长度在500～700bp之间,与预计扩增长度相一致。分离的7株菌对四环素的耐药基因扩增均呈阴性。

图 1

M:Marker; 1～7:对应的菌株分别为A1, C1, R1, T1,T2, T3,B1;8:阴性对照;9:阳性对照。图 1 Amp引物PCR产物电泳结果

本研究从酸奶中分离得到的乳酸菌数量较其他发酵食品中分离得到的乳酸菌少,原因在于其他发酵食品如泡菜、熏肉等属于自然发酵,微生物种群丰富。而酸奶中多为人工接种,种类较少^〔6〕。从分离的7株乳酸菌的药敏试验和PCR反应结果来看,部分菌株对抗生素耐药情况与其基因型并不完全符合。原因可能在于相应的耐药基因并没有表达,或者出现耐药基因漏检的现象,文中设计的Tet抗药基因扩增引物,为微生物对四环素产生耐药的2种常见基因Tet(M),和Tet(W)的简并引物。除这2种基因之外,还可能存在其他对四环素产生耐药的基因^〔7〕。所以从理论上讲,可能会存在漏检问题,尚需进一步研究。值得注意的是,菌体的耐药性虽然对人体服用抗生素后的乳酸菌定植于肠道、调节菌群失衡具有一定意义,但是,一些乳酸菌可能主动或者被动通过质粒或者转座子等传播耐药性,这对于人类控制微生物耐药性的发展不利。所以,发酵食品中乳酸菌耐药性值得深入探讨。