2010, Vol. 26
内毒素是一种由脂多糖蛋白质和磷脂组成的复合物,与革兰阴性细菌细胞壁相连.细菌在存活状态下释放内毒素,当细菌死亡自溶时释放出内毒素.内毒素与人类健康密切相关.一定剂量的内毒素在免疫功能低下或有创面情况下侵入人体,产生致热反应、内毒素血症、休克和弥漫性血管内凝血等,近期研究表明,内毒素在中暑发病中起着不可忽视的作用〔1〕,对人体健康危害极大.国外自1970年开始环境内毒素的相关研究.目前国内有关环境内毒素的研究较少,并且还未制定环境中的内毒素标准.为有助于对环境内毒素危害的预防、监测和标准制定,本文对国内外环境内毒素的研究作一综述.
1 环境内毒素 1.1 空气中内毒素细菌死亡后,释放出的内毒素由于人或动物活动等因素粘附于各种尘埃上形成气载内毒素。气载内毒素是空气中生物气溶胶的重要组成部分,在空中稳定存在,有增加积累的可能性,可对机体产生持续的毒害作用。有研究显示,犊牛舍空气内毒素深度为44~262EU/m3、猪舍398~10000EU/m3、兔舍65~217EU/m3〔2〕;医院病房内外内毒素的浓度分别为33~276EU/m3和66~512EU/m3〔3〕;柏林郊区内毒素浓度为＜3.0~27.8EU/m3〔4〕。这些场所的内毒素浓度部分超出了对人体无影响的推荐标准(100EU/m3)〔5〕,可能会对处于该场所的人体健康产生一定的影响。
1.2 水中内毒素水中的内毒素是由于其中的革兰阴性细菌死亡后释放或者是通过被污染的管道。当被内毒素污染的水通过消化道、破损的皮肤表面、水气吸入、静脉注射或者透析进入人体后,就会对人体产生各种损害〔6〕。
世界各地都有水中内毒素污染的报道。美国塔霍湖12.5~125EU/mL〔7〕;德国塞纳河73~680EU/mL〔8〕;长江武汉段98.23~103.73EU/mL,汉江武汉段84.71~88.09EU/mL〔9〕;William等近30年来对美国、加拿大、瑞典、芬兰等地的水源调查结果显示,水源水中内毒素的含量范围为29.1~434EU/mL〔7〕;黄清泉等〔10〕检测我国自来水、蒸馏水中的内毒素平均含量分别为7.5和1.5EU/mL。
RapalaJ等〔11〕调查了国外的9个饮用水处理流程,内毒素去除率在78%~98%之间。段凌等〔9〕调查了武汉市2家自来水处理厂,内毒素去除率分别为51.76%和81.65%。内毒素在高温条件下,每经过一次热压处理(115℃,20min)其含量衰减仅为60%~70%〔12〕,表明自来水处理工艺对内毒素有去除效果,但含量仍较高,并且杀灭细菌与内毒素减少并不同步,因此环境中致病菌达标并不意味着毒素含量较低。
1.3 土壤与固体废弃物中内毒素RylanderR报道垃圾处理中心内毒素含量:垃圾聚集为0~5ng/m3,堆肥为7~53ng/m3,垃圾燃料厂为2~4ng/m3〔13〕。生物废弃物的渗出内毒素含量为450000~1500000EU/mL〔14〕。ZuckerBA报道,柏林郊草地的内毒素含量为5900~59000EU/g,土壤的内毒素含量为3000~7400EU/g〔4〕。
1.4 职业暴露于内毒素DutkiewiczJ等〔15〕监测了波兰东部36个农作物处理点,发现农场工人在处理农作物时会暴露在较高的内毒素浓度下,谷物脱粒时空气中的内毒素浓度为0.05~993μg/m3、破碎谷物为40.2~69.6μg/m3、土豆处理为0.0095~0.0155.g/m3、亚麻脱粒为16.9~172.1μg/m3、处理荨麻叶为0.8~715μg/m3、处理薄荷叶为0.18~16.0μg/m3;OIdenburgM等〔16〕监测了德国一家棉花纺织工厂内毒素含量为4~7.177EU/m3;RylanderR〔13〕报道内毒素职业暴露分别为:农场为50~2800ng/m3、牛奶场为25~3480ng/m3、家禽养殖场为33~301ng/m3、动物饮料场为0.2~1870ng/m3、谷物场粉尘为286~721ng/m3。
2 内毒素检测方法 2.1 家兔热原试验法家兔热原试验最早用于内毒素检测。将一定的内毒素静脉注射到家兔体内,在规定时间内观察家兔体温升高的情况,以判定内毒素中所含的热原量。此方法有很多限制,它的最大缺点是不能定量,此外不能大规模的检测样品,家兔对内毒素反应有个体差异,敏感度不高,费时等缺点导致其有被逐渐淘汰的趋势。
2.2 脂多糖(LPS)的生物学标记的探测分析法气相层析法(gaschromatography)和质谱分析法(massspectrometry)(GC.MS)都曾经被用来探测LPS的β-3-羟基脂肪酸,虽然这些方法能够检测出样品中LPS的种类并且能敏感地检测出样品中LPS的浓度,但是仍然不能准确地检测出有生物学作用的内毒素浓度。
2.3 鲎试验法(limulustest)鲎试验法又称为鲎变形细胞溶解物试验(limulusamoebocytelysateassaysLAL),是目前最主要的内毒素检测方法,也是现在内毒素检测的金标准。鲎(limulus)暴露于内毒素时,鲎血淋巴内阿米巴样细胞中的C因子、B因子、前凝固酶被内毒素激活,激活的C因子、B因子和前凝固酶使可凝固蛋白凝固,致使鲎血淋巴发生凝结反应,以凝胶形成时间或凝胶形成时发生的吸光度变化来测定内毒素的浓度。优点是较家兔热原法具有快速、简便、重复性好、灵敏度高(0.01~1ng/mL)、易推广和标准化。近十几年来,在同位素标记、免疫电泳等技术辅助下方法灵敏度进一步提高。缺点是存在着误差较大、不易区分弱阳性和阴性,并且试剂的制备需要捕杀大量鲎、对边缘样品不易判断和试剂消耗量大〔13〕。
经过研究,鲎试验法已进行了诸多改进。其中,定量动态显色法鲎试验(thequantitative,kineticchromogenicLAL)使用最为广泛。酶被内毒素激活后,反过来作用在含有p-硝基苯胺(pNA)发色底物上,p-硝基苯胺从底物中释放出来,并显示黄色;再通过吸光度与内毒素的标准曲线计算样品内毒素含量。优点是能探测到有生物学活性的内毒素;能进行大量样本的分析。缺点是不能探测到有包膜结合的LPS,会低估某些样品中内毒素的浓度。
2.4生物传感器检测法生物传感器是目前新兴的内毒素检测方法,大部分仍是基于鲎试验法中鲎阿米巴法溶解产物与内毒素的LPS的凝结反应。该类检测法具有测量速度快、敏感性高、最低检测限低等特点,目前,国内外有较多对生物传感器检测内毒素的研究。
熊兴良等〔17〕研制了一种基于石英晶体的液体阻尼效应的压电生物传感器。利用压电石英晶体灵敏的响应内毒素与LAL凝交反应过程引起液体流变学性质(黏度和密度)变化这一特点。具有结构简单、自动化程度高、在最低检测限(0.01pg/mL)和检测耗时(100~110min)上较鲎试验均有较大的优越性。
Keat等〔18〕发现了一种压磁应力传感器(stress.respinsivemagnetoelasticsensors),这种传感器能感应鲎试验的凝胶形成(粘滞的改变),将带状的12.7mm×6mm×28mm的传感器侵入鲎试验的溶液中,记录下的传感器共振振幅降低值为时间函数。内毒素的浓度和由振幅时间曲线一阶倒数最小值决定的最大凝结速度有着极好的相关性。在灵敏度为0.06EU/mL鲎凝胶试验中、传感器能在20min内探测到0.0105EU/mL的内毒素浓度,所以该方法时间短、花费低,并且与其他光学方法不同的是溶液的颜色对传感器的内毒素探测没有影响。
JamaesEA等〔19〕发现一种消散波光导纤维的生物传感器,共价固定在光纤探针表面的多粘菌素B选择性地结合荧光标记的LPS,未标记的LPS可以通过竞争性抑制实验来检测。该法不仅能探测LPS还能确定LPS的血清型。其他能俘获LPS分子的物质,例如,抗体、外源凝集素或者抗生素,都能够用于该试验方法。这种传感器的优点在于速度很快(30s)并且能够适应复杂环境,如能用于血浆和污染的水中内毒素的测量。它的另一个显著特点是不需要任何酶使LPS可见,所以它对菌血症个体血浆中的蛋白酶完全没有反应。
LimbutW等〔20〕发现一种电容性生物传感器,将美国鲎中分离的内毒素和蛋白固定在生物传感器探头的硫醇自组装膜上,注入内毒素样本,记录下电容信号的降低数值,在检测的限值为1.0×10-3mol/L的最宜试验条件下,1.0×10-3mol/L~1.0×10-10mol/L范围内的内毒素浓度和电信号成线性关系。该方法优点之处在于敏感性高,检测速度快(13~18min)。并研发了具有自我再生表面电极的生物传感器,可实时监控发酵过程中LPS含量。
2.5 酶联免疫测定法(ELISA)ELISA法也是目前新兴的内毒素检测方法,它是基于抗原抗体的酶联免疫测定法,由外加热原质刺激巨噬细胞后产生的内热原物质如肿瘤坏死(TNF)因子白细胞介素1(IL-1)等而进行测定的。
徐修礼等〔21〕用自制的2株抗LPS.mAbC3A2和H3D3分别作为包被和酶标记mAB建立双抗体夹心ELISA法,检测血浆中的LPS,具有耗时少(100~110min)、检测线低(0.01pg/mL)、准确性好(误差＜5%)、操作简便、可定量LPS的优点。
ZhangGH等〔22〕发现,内毒素与鲎阿米巴样溶解产物反应产生的具有28个氨基酸片段的凝固蛋白原-鲎缩氨酸C(limuluspiptideC)是一种单克降抗体,将这种抗体与ELISA连用后,发生类缩氨酸C的免疫反应,可能得到吸光度和内毒素浓度呈线性关系。这种连用技术特异性好,能检测到水中0.001EU/mL内毒素浓度和血浆0.01EU/mL内毒素浓度,并且该技术LAL消耗少,样本的颜色和混浊对实验没有影响,对自然的葡聚糖完全没有反应。
3 内毒素有关标准目前中国和欧盟药典规定注射用水中的内毒素含量应＜0.25EU/mL〔23〕。此外,内毒素的环境质量标准也在研究之中。Rylander〔5〕建议:避免有机粉尘毒效应的空气内毒素限值为200ng/m3;空气中内毒素人体无影响水平为100ng/m3;避免气道炎症空气中内毒素限值为＜10ng/m3。HeederikD等〔24〕建议环境内毒素含量的无影响水平为9~170ng/m3。荷兰职业标准专家委员会(TheDutchExpertComitteeonOc.cupationalStandards,DECOS)提出的每日8h职业暴露的卫生标准为50ng/m3(4.5ng/m3)〔25〕。由于饮用水与健康密切相关,今后其卫生标准中也应补充内毒素的安全限值。
4 小 结综上所述,内毒素在环境中广泛存在并且是人类健康的重要威胁,而国内外环境内毒素的标准尚不完善,也没有一种快速且适宜现场实时监测的检测方法,并且鲎作为珍稀动物日益受到保护。因此,因内外学者一直致力于研究实时、快速、灵敏的新检测方法,为早期发现环境内毒素的污染与控制提供技术支持;同时还应结合流行病学研究提出安全限值以保护人类健康及公共卫生安全。
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