氧化型染发剂中有较多使细胞遗传物质产生突变的有害成分,所以在对染发剂进行安全性评价时要进行致突变性检测^{〔1, 2〕}.鼠伤寒沙门菌/回复突变试验(Ames test)和体外哺乳动物细胞染色体畸变试验(CA test)是目前测试化学物品致突变性的常用方法.为了提高染发剂的卫生管理和监督工作,优化完善有关试验方法,解决染发剂产品致突变性结果判定等问题,本实验室与日本相关实验室合作开展了染发类化妆品的安全性评价工作.双方实验室采用以上2种致突变试验方法对8种受试样品进行测试,比较了中日双方实验室体外哺乳动物细胞染色体畸变试验和Ames试验结果的一致性.结果报告如下.

采用由日本相关方面提供的8种氧化型染发剂产品,样品名称分别为PS2N4,YL210,BA,PS2N6,MAC,HT26,DE4/77和EX54。各样品均为I剂(苯胺类组分)和II剂(氧化剂)包装,按使用比例混合后用于试验。

中国仓鼠卵巢细胞株(CHO;中方实验室使用,中国协和医科大学细胞中心);中国仓鼠肺细胞株(CHL;日方实验室使用);胎牛血清、胰蛋白酶(美国Hyclone公司);6-磷酸葡萄糖、辅酶Ⅱ(美国Sigma公司);其余试剂均为分析纯。组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌TA97、TA98、TA100、TA102等4株菌株,经鉴定符合实验要求,活化系统为多氯联苯诱导的SD大鼠制备肝匀浆。

试验设受试物组、阴性对照组和阳性对照组,并在加入和不加入代谢活化系统的条件下进行。细胞接种于培养皿中培养24h,受试物染毒2h,代谢活化组同时加入S₉mix。染毒后继续培养细胞,24h后收获,收获前4h用秋水仙素处理细胞。低渗,制片并常规Giemsa染液染色,镜下观察记录染色体结构畸变,计算染色体畸变率。双方实验结果的一致性分析比较采用Fisher法。+S₉或/和-S₉情况下,试验结果为阳性,并有可重复性,即判定为致突变性阳性。

选用鼠伤寒沙门菌TA97、TA98、TA100、TA102等4株菌株,用大鼠肝脏微粒体酶(S₉)作为体外代谢活化系统,采用平板掺入法,37℃培养48h,以可观察到的菌苔变薄的最低浓度做为试验的最高浓度。计算每皿回变菌落数(±s),受试物经4个菌株测定后,无论在+S₉或/和-S₉条件下,回变菌落数达溶剂对照≥2倍,并呈剂量-反应关系,判定为致突变阳性。

采用SPSS 13.0软件进行统计处理。采用χ² 检验比较染色体畸变率的差异。

中方实验室检测结果显示,8种染发剂样品中,YL-10(+S9)和BA(-S9)与阴性对照组比较,均有一个剂量引起染色体畸变率增加,差异均有统计学意义(P＜0105),呈现一定的致突变性;日方实验室结果显示,8种染发剂样品均具有致突变性。双方实验室体外哺乳动物细胞染色体畸变试验阳性结果的一致率为25%,差异有统计学意义(P＜0101)。

中方实验室检测结果显示,BA、PS-N6无致突变性,其余6种样品为致突变阳性;日方8种样品均具有致突变性。双方实验室Ames试验阳性结果的一致率为75%,差异无统计学意义(P>0105)。

从染色体畸变试验和Ames试验结果显示,日方实验室2项试验8种染发剂样品均具有致突变性,2种方法的检出一致率为100%;中方实验室2项试验分别检出2种和6种致突变阳性样品,中方2种方法的检出一致率为25%。

表 1

表 1 中日双方试验结果比较

表 1 中日双方试验结果比较

氧化型染发剂具有一定的致突变性,为了保证消费者使用安全,对其进行致突变性检测是染发产品安全性评价中的关键^{〔3, 4〕}。本研究结果表明,双方Ames试验结果的一致性比较好,而体外哺乳动物细胞染色体畸变试验结果差异较大。在采用相同试验方法的情况下,分析后者的原因,可能与双方试验时选用的细胞株不同、最高剂量设定方法不同以及染发剂Ⅰ剂与Ⅱ剂混合作用时间不同等因素有关。为了增强双方试验结果的可比性,有必要对体外哺乳动物细胞染色体畸变试验中关键操作步骤做出标化和优化,以使该方法在致突变性检测方面更具应用意义。

目前,欧盟对染发剂致突变性安全性评价常使用细菌回复突变试验、哺乳动物细胞基因突变体外试验、体外哺乳动物细胞染色体畸变试验、体外微核试验和体外哺乳动物细胞非程序化DNA合成试验等5种体外试验方法^〔5〕。其目的是要全面评估某种物质的潜在致突变性,获得有关基因突变、染色体断裂畸变、染色体数量改变及DNA损伤方面的详细资料。本研究中,中方实验室2种方法有2个受试样品试验结果具有一致性,而日方2种方法结果全部一致。为了保证染发剂安全性评价的全面性和完整性,应对其余3项试验进行补充和验证,必要时还应追加体内哺乳动物细胞微核试验。