近年来,由室内装修引起的室内空气污染问题日趋严重,已成为危害公共健康的重要环境因素之一.甲醛和苯是室内主要挥发性有机物,二者常具有共同污染源,可能对暴露人群产生联合毒性效应.为探讨甲醛和苯联合神经毒性作用,本研究采用单细胞凝胶电泳法和氯化钾-十二烷基磺酸钠(KCL-SDS)沉淀法测定小鼠脑细胞DNA损伤,观察不同浓度甲醛和苯单独及联合吸入染毒致小鼠神经系统毒性作用,为综合评价甲醛和苯的安全性提供科学依据.

(1)仪器与试剂:50L静式染毒柜(山西医科大学木器厂);CD-1大气采样器(江苏省金坛市荣华制造有限公司);DYY-7C电泳仪、DYCP-33A电泳槽(北京市六一仪器厂);BX51荧光显微镜(日本OLYMPUS公司);RF-540荧光分光光度计(日本岛津公司);超低温高速冷冻离心机(香港力抗发展有限公司)。甲醛(分析纯,天津市化学试剂三厂);苯(分析纯,天津市科密欧化学试剂开发中心);正常熔点琼脂糖(NMPA)、低熔点琼脂糖(LMPA)、十二烷基肌氨酸钠(SLS)、溴化乙锭(EB)(美国Amresco公司);十二烷基磺酸钠、Hoechst33258荧光染料、小牛胸腺DNA(美国Sigma公司);蛋白酶K(美国Merk公司)。(2)实验动物:采用健康清洁级昆明种纯系小鼠(山西医科大学动物中心)60只,鼠龄7周,体重18～22g,雌雄各半,在屏障环境中饲养,饲养条件为(24±2)℃,相对湿度为(55±10)%。(3)动物分组与染毒:将小鼠随机分为10组,每组6只,分别为对照组(清洁空气);单纯甲醛1.0,310,510mg/m³和苯500,1500,2500mg/m³组;甲醛苯联合染毒(015甲醛+250苯)、(115甲醛+750苯)、(215甲醛+1250苯)mg/m³组。采用封闭静式吸入染毒,每天2h,连续染毒14d。次日处死小鼠。无菌取出脑组织,制备脑细胞悬液待用。(4)单细胞凝胶电泳法:按文献^〔1〕方法操作,在全磨砂载玻片上辅3层凝胶,将凝胶在4℃下裂解1h后,在25V、300mA碱性条件下电泳20min,用EB20μg/mL染色,24h内在荧光显微镜200倍视野下观察结果,每张片子随机观察50个细胞,用彗星图像分析软件测量彗星细胞尾部DNA含量及彗星细胞尾距。(5)DNA-蛋白质交联(DPC)含量测定:采用KCL-SDS沉淀法^〔2〕,并计算DPC系数。计算公式:DPC系数=交联DNA/(交联DNA+自由DNA)。(6)统计分析:采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析和最小显著差法(LSD)两两比较。

单独给予甲醛和苯各剂量组小鼠脑细胞DNA均有不同程度损伤,与对照组比较,甲醛和苯单独染毒低、中剂量组脑细胞彗星尾部DNA含量增高,尾距增大(表 1)。与甲醛、苯单独组分别比较,联合染毒各剂量组彗星尾部DNA含量增高,尾距增大(P＜0.05)。甲醛和苯单独染毒中、高剂量组及联合染毒各剂量组的DPC系数高于对照(P＜0.05),随染毒剂量增加而升高。

表 1

表 1 甲醛、苯单独及其联合染毒对小鼠脑细胞DNA的影响(±s)

表 1 甲醛、苯单独及其联合染毒对小鼠脑细胞DNA的影响(±s)

甲醛和苯是室内空气中最主要的2种污染物,流行病学调查和动物实验显示,甲醛和苯具有神经毒性^{〔3, 4〕}。本次实验结果显示,甲醛、苯单独及其联合染毒均能引起小鼠脑细胞DNA损伤,低浓度时主要引起DNA链断裂,拖尾现象明显,较高浓度时可以引起明显的DNA-蛋白质交联作用,与文献结果一致^〔5〕。表明甲醛和苯对DNA的损伤类型与其染毒剂量密切相关,其作用机制可能是当细胞电泳时,在DNA发生交联作用的情况下,可使核DNA泳出受阻而积聚在核内,从而使细胞不出现拖尾现象^{〔6, 7〕}。

与单独染毒比较,联合染毒低、中剂量组彗星细胞核DNA产生断片增多,拖尾现象明显,高剂量组DNA-蛋白质交联物含量增多明显。提示甲醛、苯联合染毒可引起小鼠脑细胞DNA断裂和DPC效应,加重DNA损伤程度;联合染毒对小鼠脑细胞的DNA损伤作用明显强于单独染毒作用,表明二者联合染毒对神经损害可能具有协同作用。