微波技术已广泛应用于国防、工农业生产、信息产业、医疗和科学研究等各个领域,给人们的工作和生活带来了诸多益处,但其所产生的微波辐射已成为当今人类生存环境中主要污染源之一。研究表明,睾丸是微波、电磁脉冲等电磁辐射敏感的靶部位之一^{〔1, 2〕}。微波辐射对人类生殖系统的影响直接关系着家庭和社会安宁以及人类未来。本研究从DNA断裂损伤的角度,探讨低功率微波照射对雄性小鼠睾丸生殖细胞的影响,为阐明微波辐射对雄性生殖系统影响机制提供实验依据。

正常熔点和低熔点琼脂糖(美国Sigma公司);Triton-100、二甲基亚砜(美国Amresco公司);微波信号发生器(泉州荣盛达电讯器材厂);DYY-Ⅲ-6B型电泳仪 (北京六一仪器厂);DM iRB型荧光倒置显微镜(德国Leica 公司)。

清洁级昆明种雄性小鼠40只,体重 18~22 g,(上海斯莱克实验动物有限公司);许可证号:SCXK (沪)2003-0003。随机分为4组,1个对照组和辐照Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组(分别照射5,10,15 d),每组10只。将小鼠置于一面开口45 cm²的铁皮箱内照射,微波辐射源平均功密度为250 μW/cm²,频率为900MH z的连续波,全身24 h暴露,辐射环境温度为23~27℃,相对湿度为30%~40%。

分别于照射的第5,10,15 d处死辐照组小鼠,对照组小鼠于第15 d处死。摘取双侧睾丸,用预温的37℃生理盐水冲洗2次,除去包膜,剪碎,加入2 mL磷酸盐缓冲液(PBS),经150目不锈钢网过滤,冲洗2次,收集细胞。1 000 r/m in离心10 m in,弃上清,加入PBS重悬,调整细胞浓度为(1~2) × 106/mL。4 ℃保存。

彗星实验根据文献〔3, 4〕方法略作修改: 吸取1%正常熔点琼脂糖110 μL滴于全磨砂载玻片上,盖上盖玻片,4℃放置10 m in;将25 μL细胞悬液(100个/μL)和 75 μL 0.8%低熔点琼脂糖混匀,吸取75 μL滴在第一层胶上,盖上盖玻片,4℃放置10 m in。待胶凝固后,置于4 ℃的细胞裂解液(NaCl 2.5 mol/L、Na²EDTA 100 mmol/L、Tr is 10 mmol/L、1%的十二烷基肌氨酸钠,pH 10,临用前加1%的Tr-itonX-100,10%的二甲基亚砜)中避光裂解至少1 h。裂解后用Tris-HCl (pH7.4)冲洗2次,置4℃预冷的电泳液(乙酸钠300 mmol/L、Tr is 100 mmol/L、Na₂EDTA 100 mmol/L,pH 13)中解旋20m in。电泳条件为25 V,250 mA,电泳20 min; PBS中浸洗2次,滴加20 μg/mL溴化乙锭(EB)50μL染色。 用荧光显微镜(400 ×)观察测量,每只动物随机观察50个细胞,每组计数500个细胞并计算拖尾率,数码相机拍摄后采用 CASP 1.0图像分析。指标包括尾长、尾部DNA%和Olive尾矩(OTM)等。

采用SPSS 11.5软件处理数据,对拖尾率进行χ²检验,其他DNA损伤指标进行单因素方差分析,并用最小显著差法(LSD)对各组进行两两比较(α=0.05)。

显微镜下观察对照组细胞核大小均一,为圆形荧光团,荧光强度均匀,边缘光滑,无拖尾现象。 照射组DNA受损细胞呈现出像彗星一样的拖尾现象,并且随着微波照射时间的增加,彗星尾巴加长,尾部荧光强度增强,彗星头部直径减小。此外,照射10与15 d组还出现一定数量的凋亡细胞,彗星头小,尾大且尾型偏圆。

表 1

表 1 低功率微波辐射对雄性小鼠睾丸细胞DNA 损伤作用

表 1 低功率微波辐射对雄性小鼠睾丸细胞DNA 损伤作用

各辐照组均可导致睾丸细胞DNA出现不同程度的脱尾,且随着辐照时间的增加,拖尾率逐渐增加与对照组比较差异均有统计学意义(P < 0.01),并呈时间效应关系。

表 2

表 2 低功率微波辐射对雄性小鼠睾丸细胞DNA 损伤程度

表 2 低功率微波辐射对雄性小鼠睾丸细胞DNA 损伤程度

各辐照组尾长、 尾部DNA%及OTM值均出现不同程度升高,与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.01),损伤程度随着辐照时间的增加呈时间效应关系。其中,15 d组对细胞的损伤程度最重,与其它辐照组比较差异亦有统计学意义(P < 0.01)。

单独以尾长或尾部DNA%作为分析指标往往不能全面真实反映DNA损伤作用,一些综合性分析指标,如尾矩、O live 尾矩(OTM)、彗星矩、尾惯量等^〔5〕能够较全面地评价DNA损伤程度。本研究结果表明,低功率微波辐射能使雄性小鼠睾丸细胞DNA彗星图像出现尾长、尾部DNA%以及OTM指标升高,且随时间的增加而升高,提示低功率微波辐射对小鼠睾丸细胞DNA的损伤具有累积效应性。

微波产生的生物学效应主要分为热效应和非热效应。微波辐射的热效应是由于电磁波辐射场照射生物体,引起组织器官的加热作用而产生的生理影响。长期的低功率密度(< 1 mW/cm²)微波辐射,在生物体中并不能产生明显的热量,主要引起非热效应^〔6〕。本研究采用900MH z,250 μW/cm2低功率微波辐射源,其对雄性小鼠睾丸细胞DNA损伤可能和非热效应有关。鉴于移动电话的发射频率为800~1900MH z,长期移动电话微波暴露是否存在生殖毒性风险值得进一步研究。