随着全球脊髓灰质炎病毒的消灭,由非脊灰肠道病毒 (NPEV)引起的急性驰缓性麻痹(AFP)越来越引起人们的关注。对肠道病毒(EV)进行诊断和鉴定的金标准是用敏感的细胞系培养和分离病毒,继而用EV组合血清进行病毒型别鉴定。但此法操作不仅繁琐费时,而且无法对所有的血清型进行鉴定,更不能对一些抗原变异株或新型别毒株进行鉴定^〔1〕。近年来已有应用分子生物学方法对EV进行分型鉴定^{〔2, 3, 4, 5, 6〕},很多新型EV也通过该方法鉴定出来。为了解NPEV 的型别和流行病学规律,为疾病的控制提供科学依据,本研究采用简并引物和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法对浙江省2006-2008年分离的非脊灰肠道病毒进行诊断和鉴定。现将结果报告如下。

2006-2008年从AFP病例的粪便标本中分离的肠道病毒31株(浙江省AFP病例监测系统脊灰实验室)。

采用横纹肌肉瘤RD细胞进行病毒分离;依照WHO5脊灰病毒检验手册6,采用标准脊灰I、 、型诊断血清(世界卫生组织提供),经微量中和试验法对病毒分离物进行血清学鉴定,不能被脊灰标准血清中和者判为非脊灰肠道病毒(NPEV)。

采用ReansyM in iK it试剂盒(德国QIAGEN公司),按操作说明书提取RNA。肠道病毒简并引物设计参照文献〔4〕,187:5′-ACIGCIGY IGARACIGGNNCA- 3′; 188:5′-AC IGC IGT IGARAC IGGNG-3′; 189:5′- CARGC IGC IGARACIGGNGC-3′; 222:5′-C ICCIGG IGGIAYRWACAT- 3′。

采用一步法 RNA PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)。反应体系:10×反应缓冲液5 μL,MgCl₂(25 mm ol/L)10 μL,dNTP混合物(10 mm ol/L)5 μL,RNA酶抑制剂(40U/μL)1 μL,AMV逆转录酶(5U/μL)1 μL,Taq酶(5U/μL)1 μL,引物187,188,189,222(20 pm ol/μL)各1 μL,模板RNA 10 μL,补足无RNA酶水至50 μL。反应条件:50℃ 30 m in逆转录,94℃预变性3 m in,94℃变性40 s,50℃退火60 s,72℃延伸60 s,40个循环,72℃延伸10 m in,然后转入4℃ ^〔5〕。取扩增产物5 μL,用 1.5%琼脂糖电泳,根据DNA标准分子质量(M arker)位置对扩增片段进行确认。

扩增阳性的PCR产物送上海英骏生物技术公司进行序列测定;使用基本局部相似性比对搜素工具(BLAST)以分离毒株序列与GenBank中的全部核苷酸序列进行比对,若与某一血清型毒株核苷酸序列同源性高于75%,同时与其他型别毒株同源性低于70%,即认为分离毒株属于该血清型。

测定序列采用DNAMAN软件进行序列分析。进化树的构建方法采用邻位连接法(ne ighbo r-jo ining,NJ),可信度评估自举法bootstrap设置为1 000。

表 1

表 1 2006- 2008年浙江省NPEV基因分型鉴定结果

表 1 2006- 2008年浙江省NPEV基因分型鉴定结果

表 1可见,31株肠道病毒分离株共鉴定出16个血清型,其中COXA4为4株,COXB2为1 株,COXB3为4株,COXA21为2株,EV71为1株,EV84为1 株,ECHO3为1株,ECHO7为3株,ECHO11为1株,ECHO12 为2株,ECHO13为2株,ECHO14为3株,ECHO20为2株,ECHO24为1株,ECHO25为2株,ECHO29为1株。

图 1

图 1 肠道病毒分离株种系进化树分析

将31株病毒株的基因序列运用DNAMAN进行排序分析,并构建种系发生树分析比较。31 株非脊灰肠道病毒(NPEV)明显地分化为3支,包括肠道病毒A组(HEV-A)、肠道病毒B组(HEV-B)和肠道病毒C组 (HEV-C)。06-167、06-138和06-150与GenBank进行基因序列的BLASTn分析时,无核苷酸序列与之匹配,但进行 BLASTx分析发现06-167、06-138与ECHO7同源性为97%,从种系发生树可以看出,这两株毒株与HEV-B在同一簇,与 06-21(ECHO7)又在同一个小分支上,推测该毒株可能为 ECHO7血清型的高度变异株,06-150与COXA21的同源性为 97%,该毒株与HEV-C在同一簇,与06-131(COXA21)又在同一个小分支上推测该毒株可能为COXA21血清型的高度变异株。

近年来,随着分子生物学技术的发展,国内外陆续建立了一些基于RT-PCR,然后进行核苷酸序列分析或分子杂交的方法用于肠道病毒分型鉴定的方法,并使用此法鉴定了许多新型EV。本研究根据文献报道设计了几对引物,对浙江省 2006-2008年从急性弛缓性麻痹病例中分离到的31株非脊灰肠道病毒进行了VP1区基因扩增和序列分析。结果显示,COXA4、COXB3所占比例稍高,表明近几年来浙江省有柯萨奇组病毒的流行,但是否为浙江省近3年非脊灰肠道病毒流行的优势毒株,需要结合这几年的资料分析来进一步进行判断。本次检测中分离到了ECHO13和Ev71型病毒,ECHO13 和Ev71型病毒,是能导致无菌性脑膜炎和手足口病的典型病毒^〔7〕,并可能引起暴发。2008年在中国就发生了由Ev71型病毒引起的手足口病流行。另外还分离到1株新型肠道病毒 EV84,对这些新型肠道病毒详细的临床表现和流行病学特征有待进一步研究。浙江省本次分离到的NPEV中,HEV-A和 H EV-B和HEV-C组病毒都有,以H EV-B组较多,HEV-B和 H EV-C组中的某些病毒具有基因多样性的特点,是主要流行病毒。最近报道了脊灰病毒和HEV-C组病毒之间可能存在遗传重组;在柬埔寨就发现了HEV-C组病毒和脊灰病毒Sabin 3型之间有遗传重组现象^{〔2, 7〕}。浙江省一直使用口服脊灰活疫苗,在未来也有可能发生遗传重组的现象,应引起关注。 肠道病毒型别众多,新型EV在世界广泛分布,只有找到特异的病原体采取针对性措施才能有效的控制疾病的流行^〔8〕。