人类免疫缺陷病毒(H IV-1)耐药性是艾滋病抗病毒治疗失败的主要原因,随着高效抗逆转录病毒治疗(HAART)的推广,艾滋病的耐药问题日益突出。H IV-1耐药性与病毒基因组的高度变异特性、药物的选择压力、机体的免疫压力、药代动力学因素、服药依从性等多种因素有关^{〔1, 2, 3〕},而这些因素在不同地区和不同感染者/患者群体中分布及其效应的差异,可能使各地和各群体发生H IV-1耐药性的比例及耐药特征有所不同。2008年5-11月对广西壮族自治区南宁和柳州市的艾滋病患者进行了调查,旨在分析与H IV-1耐药性有关联的因素,为当地制定H IV-1耐药性的防制措施提供参考依据。

在南宁、柳州市随机抽取已经接受治疗的艾滋病患者114例,治疗时间为3个月~3.5年。

病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕;RevertA id^TM F irst Strand cDNA Synthesis K it (美国Fe rm en-tas公司);Taq酶、10 mmo l/L dNTP M ixture〔宝生物工程(大连)有限公司〕。

调查内容包括性别、年龄、职业、感染途径、治疗时间、治疗方案、毒副反应、最近1个月的服药依从性等。采集研究对象外周静脉血10 mL。

(1)引物设计:根据我国H IV-1主要流行株pol区序列设计引物Gag-oute r (5′-GGGTTTTGGCTGAG- GCAATGAG-3′)、Po l-outer (5′-GCTTGCCAATACTCCRTC- CACCA-3′)、GR1(5′-GTTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC- 3′)、PR2(5′-CTTTTGATGGGTCATAATATACTCCATG-3′)、 Seq1(5′-GAGCCAACAGCCCCACCA-3′)、Seq3(5′-GAATCTC- CCTGTTTTCTGCCA-3′)、SeqF (5′-GCCTGAAAATCCATA- CAATACTCC-3′)和SeqR (5′-GGATGCGGTATTCCTAATT- GAACTTC-3′)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。 (2) H IV-1 pol区序列扩增及测序:从血浆中提取病毒RNA,逆转录为cDNA,逆转录引物为Po l-oute r。第1轮扩增引物为 Gag-outer/Po l-outer,反应体系25 μL,其中cDNA模板5 μL,上下游引物各为0.4 μm o l/L,dNTP 200 μm o l/L,MgCl₂ 1.5 mm o l/L,Taq酶1.5 U。反应条件:94℃ 5 m in,57℃ 60 s,72℃ 150 s,1个循环;94℃ 30 s,57℃ 30 s,72℃ 120 s,30个循环;72℃ 10 m in。第2轮扩增引物Seq1/Seq3进行,反应体系50 μL,其中第1轮产物5 μL,上下游引物各0.4 μmo l/L,dNTP 200 μmo l/L,M gCl₂ 1.5 mmo l/L,Taq酶2.5 U。 反应条件:94℃ 2 m in;94℃ 30 s,57 5℃ 30 s,72℃ 120 s,35个循环;72℃ 10 m in。当扩增失败时,第1轮扩增引物改用GR1/PR2,反应体系与条件不变。回收约1300 bp的第2 轮扩增产物,由北京三博远志生物技术公司测序;测序引物为 Seq1、Seq3、SeqF和SeqR。(3)耐药性分析:用contig软件对序列进行拼接,提交至H IV D rug Resistance Database (http:// hivdb stan fo rd edu/),获得各序列耐药性突变位点及对应的耐药性分值和耐药性总计分。根据耐药性突变计分表^〔4〕进行判断:耐药性总计分均< 15为非耐药,对任何一种药物的耐药性总计分≥15为耐药。

将待分析序列与各亚型参考株序列用 MEGA4构建系统进化树,选择Ne ibor-Jo in ing法,系统进化树用Boo tstrap法进行检验(重复100次),根据序列聚集情况确定病毒亚型。参考株序列均来自H IV Databases (http:// www h iv lanl gov)。

将患者按性别、年龄、职业、治疗方案、治疗依从性、病毒亚型等特征分组,比较各组耐药率的差异。

采用SPSS 13.0软件进行χ²检验,比较不同组耐药率。

经过扩增和测序,共获得86例患者的pol区序列,有15例患者至少对1种抗病毒药物产生低度以上耐药,总耐药率为17 44%(15/86),其中,针对蛋白酶抑制剂(PIs)的耐药1例,针对核苷类逆转录酶抑制剂(NR-TIs)的耐药14例,针对非核苷类逆转录酶抑制剂(NNTRIs) 的耐药11例,对NRTIs和NNTRIs的二重耐药11例。

表 1

表 1 HIV-1耐药性的影响因素分析

表 1 HIV-1耐药性的影响因素分析

不同性别、年龄、 民族、文化水平、治疗方案、传播途径、慢性腹泻、饮酒和病毒亚型的耐药率差异无统计学意义,而不同服药依从性、治疗时间和职业的耐药率差异有统计学意义。进一步两两比较表明,服药依从性为50%~70%的患者与依从性为70%~90% 的患者耐药率差异无统计学意义,而服药依从性为50%~ 90%者,耐药率高于服药依从性≥90%者(OR=8.591,95% CI=1.068~69.081);治疗1~2年者耐药率与治疗2~ 3.5年者差异无统计学意义;而治疗时间为1~3.5年者,耐药率高于为治疗< 1年者(OR=8.089,95% CI=1.005~ 65.099);农民的耐药率高于其他职业(工人、干部和学生)及无业人员(OR=4.223,95% CI=1.223~14.585);而无业及其他职业之间差异无统计学意义。

表 2

表 2 不同职业的服药依从性和治疗时间比较

表 2 不同职业的服药依从性和治疗时间比较

结果表明,农民服药依从性分别低于其他职业或无业患者。 不同职业的治疗时间因方差不齐而采用秩和检验,经统计,不同职业患者的治疗时间差异无统计学意义。

现有的抗逆转录病毒药物不能完全清除体内的病毒,在治疗中H IV常保持着低水平的复制,并可能在复制过程中发生耐药性突变。本次在柳州和南宁市的调查结果表明,经治疗艾滋病患者的总耐药率为17.44%,服药依从性、治疗时间和职业与耐药率的高低有关。

即往研究表明,服药依从性差可导致病毒学应答低下或无应答,而且有产生耐药性突变的危险^〔1〕,而良好的依从性可降低耐药风险,保持药物有效持续地抑制病毒复制和维持较好的免疫学反应^〔5〕。目前,提高服药依从性已经被公认是提高HAART治疗效果的重要手段。本研究也发现,服药依从性为50%~90%的患者耐药率高于服药依从性≥90%的患者,表明服药依从性≥90%时,药物抑制病毒复制的效果较好,使发生耐药的风险保持在较低的水平。从治疗时间上看,抗病毒治疗1~3.5年者的耐药率明显高于治疗时间< 1年者,表明耐药多出现于治疗1年以后,与王艳等^〔6〕报道的耐药产生平均时间为406.3 d相符,提示耐药可能是耐药相关突变积累以及病毒逐渐适应药物环境的过程,在此过程中,服药依从性的波动可能会加快耐药的产生。职业因素对耐药也产生影响,农民发生耐药的风险高于其他职业,本研究从不同职业的服药依从性进一步分析,发现农民服药依从性约为79%,低于其他职业和无业人员(约86%),由于不同职业患者的治疗时间差异无统计学意义,故推测农民服药依从性低可能是导致他们耐药率较高的原因。因此,为农民患者提供更方便的取药渠道,同时加强教育和服药督导以提高农民的服药依从性,可能有助于减少耐药的发生。