单纯性马蹄内翻足(id iopath ic congenita l ta lipe s equinov a-rus,ICTEV)是一种常见的严重影响足功能的先天性畸形,发病率约为1%~8%^〔1〕。近年来,国内外对于ICTEV病因、病理及发病机制的研究结论较多^〔2〕,但均缺乏有力的证据。临床资料和流行病学研究表明,遗传因素在ICTEV的发病过程中发挥重要作用,但其遗传方式、外显率等均不清楚,易感基因尚未确定^〔3〕。研究表明,发育调控基因家族中,TBX4及 LMX 1B基因在脊椎动物肢体发育中起重要调控作用; MMP 13基因为基质金属蛋白酶家族的蛋白,可能与关节软骨的翻转有关;COL 9A 1、COL 9A2、COL9A3基因是与软骨发育相关的基因。为了解这些位点及其附近区域是否可能包含与单纯性马蹄内翻足有关的遗传易感基因,本研究通过在上述基因内及其附近选择微卫星标记,对84个ICTEV核心家系进行传递不平衡检验(transm ission disequ ilibrium tes,t TDT)^〔4〕。结果报告如下。

84个单纯性ICETV核心家系(包括1名患者及其双亲)共252人,均由中国医科大学附属第二临床学院小儿骨外科提供。84例患者中,男性60例,女性24例(男女比例为2.5:1);年龄最大25岁,最小4个月;单侧马蹄内翻足患者 51例,双侧马蹄内翻足者33例,双侧者占39.28%。所有患者均具有典型临床表现,经X线检查及手术确诊。

抽取患儿及其父母外周静脉血各5 mL,枸橼酸钠抗凝后-20 ℃冻存备用。常规饱和氯化钠盐析法提取外周血DNA^〔5〕。

表 1

表 1 11个STR 微卫星位点PCR扩增引物序列及反应条件

表 1 11个STR 微卫星位点PCR扩增引物序列及反应条件

根据文献报道,选择与肢体发育、关节扭转及软骨发育相关的TBX4、LMX1B、 MMP13、COL9A1、COL9A2、COL9A3基因作为候选基因,选择基因内或基因附近5 CM的遗传标记-短串联重复序列,(STR)进行连锁分析;11个STR多态位点均来自于基因组数据库(genomedatabase,GDB);所有引物均由大连宝生物公司合成。

反应液总体积25μL:其中基因组DNA约40 ng,10%反应缓冲液(M gC l2 15 mm o l/L) 2.5μL,dNTP (2.0 mm ol/L)2.0 mL,上下引物(20 μmm o l/L) 各0.5 μL,Taq酶1U。循环参数:94 ℃预变性3 m in,94 ℃变性50 s,复性40 s,72 ℃延伸50 s,35个循环(复性温度见表 1),最后72 ℃延伸5 m in。所有PCR产物均经2%琼脂糖凝胶电泳检测确认。

取PCR产物7.5 μL 与等体积的载样缓冲液(去离子甲酰胺)混匀,97 ℃变性15 m in后,置于冰中骤冷,上样于6%变性聚丙烯酰胺凝胶 (19:1),含尿素7 m o l/L,50 ℃ 300 V电泳3~4 h,进行等位基因分离。银染显带,0.2% AgNO₃染色30 m in,NaOH和 0.05%甲醛的显色液显色至条带清晰,加入终止液(Na₂CO₃) 终止反应,凝胶成像仪下观察、拍照。

(1)建立TDT表格;(2)公式代数计算;(3)查表检验。检验公式为:

其中:N=等位基因数目;N _ij=TDT表中父母向子代传递/不传递的等位基因数;H _j=含j基因的杂合子父母数。

图 1

注:Ⅰ:4-5基因型；Ⅱ:3-6基因型；Ⅲ:1-5基因型；Ⅳ:3-8基因型；Ⅴ:2-7基因型；Ⅵ:5-6基因型(Ⅰ~Ⅵ分别为个体1~6)。 图 1 509-8B2F/R 位点电泳分析图

图 2

注:Ⅰ:3-4基因型；Ⅰm:3-6基因型；Ⅰf:4-5基因型；Ⅱ:1-2基因型(Ⅰ、Ⅰm、Ⅰf分别为家系1的子、母。父；Ⅱ为家系2的子)。 图 2 D6S348 位点电泳分析图

在微卫星标记 D6S348及509-8B2位点处分别检测到6,8个等位基因,片段分布在142~168及171~191 bp之间。

表 2

表 2 84个马蹄内翻足核心家系相关基因标记位点 连锁不平衡检验TDT结果

表 2 84个马蹄内翻足核心家系相关基因标记位点 连锁不平衡检验TDT结果

表 2可见,6q12-13区域 D6S348及509-8B2位点存在连锁不平衡,差异有统计学意义,提示D6S348及509-8B2位点(6q12-13区域)与单纯性马蹄内翻足相关。其他位点D17S1872、D17S806、D11S898、 D11S2017、D9S1198、D9S2160、D6S348、509-8B2、D6S1031、 D1S2743均不存在连锁不平衡,表明这些位点与单纯性马蹄内翻足无明显相关性。

单纯性马蹄内翻足病因复杂,前期经流行病学调查并未发现多例患者的大家系^〔6〕,这就限制了传统连锁分析方法的应用。以家系为基础的传递不平衡检验(TDT)是以患者核心家系成员作为内对照,用于亲代的标记等位基因是杂合型,观察可能的易感标记等位基因传递给患病子代的概率。TDT消除了群体相关分析的分层误差^〔7〕,可以利用只有一个患者的核心家系资料,获得家系资料比较容易;灵敏度高,对于遗传效能较弱的位点也能检测到。

本研究选择与肢体发育、关节翻转及软骨发育相关的基因作为候选基因,选择其所在染色体区域的微卫星标记,通过 TDT方法进行分析,结果在所选的11个微卫星标记中,发现 D6S348及509-8B2等2个位点差异有统计学意义(P < 0.01),提示该区域附近可能存在ICTEV的易感基因。而其他位点D17S1872、D17S806、D11S898、D11S2017、D9S1198、 D9S2160、D6S348、509-8B2、D6S1031、D1S2743等,经TDT检验P值均> 0.05,不存在连锁不平衡。该结果可能有2种解释:一是TBX4、LIM1B、MMP13、COL9A2基因及COL9A3基因与单纯性马蹄内翻足无相关性,可能不是单纯性马蹄内翻足的易感基因;另一可能是选择微卫星标记少,尚有待于增加微卫星标记数量来进一步证实。

D6S348及509-8B2等2个位点均位于6q12-13区域,该区域内的已知基因有COL9A1、PGM3、BA I3、EEF1A1、 COL19A1及COL12A1基因等。目前研究表明,IX型胶原基因突变可以引起轻度的发育不良,同时有报道表明,COL9A1 基因第9外显子的突变与先天性骨骺发育不良相关^〔8〕 。但未见其与马蹄内翻足相关的报道。然而,该区域的其他基因是否与ICTEV相关尚待进一步研究。本研究将继续在该区域选择其他微卫星标记位点进行TDT检验,从而获得更为精细的定位资料,为该候选区域内克隆和鉴定ICTEV遗传易感基因提供基础依据。