近年来,深部真菌感染率明显增加,假丝酵母菌是深部真菌感染的主要病原菌^〔1〕。研究显示,热带假丝酵母菌是导致假丝酵母菌感染的第2常见原因^{〔2, 3〕}。近年来,随着大量广泛使用唑类药物预防和治疗念珠菌病,导致热带假丝酵母菌唑类药物耐药率明显升高。为了探讨热带假丝酵母菌唑类药物耐药的可能分子机制,本研究监测了2005-2008年142株热带假丝酵母菌对氟康唑的敏感性,同时分析了敏感株和耐药株的热带假丝酵母菌ERG11(C tERG11)全基因序列。

收集南昌大学第一附属医院2005年7月- 2008年6月分离的热带假丝酵母菌142株,来自痰液101株,白带8株,尿液21株,血液3株,粪便6株和其他部位3株。 质控菌株为克柔假丝酵母菌ATCC 6258和近平滑假丝酵母菌ATCC 22019。

(1)菌悬液的制备:将受试菌在沙氏平板上转种2次以保证其纯度及生长力,挑取直径> l mm的菌落5 ~10个,用无菌生理盐水制备成菌悬液,紫外分光光度计调整菌悬液浊度达015麦氏单位(1 ×l0⁶~5 ×l0⁶ CFU/mL)。 (2)药物:将氟康唑(美国Sigma公司)贮藏液进行倍比稀释成10个浓度(氟康唑0.25~1.8μg/mL),以微量加样器将药液加入8 ×12孔U型微量滴定板内,每孔100μL,第11孔为菌液阳性对照,第12孔为无药空白对照,制备成最低抑菌浓度(M IC)测定板。(3)药敏实验:按照美国国家临床试验标准化研究所(CLSI)《酵母菌的液基稀释法抗真菌药物敏感试验参考方案第二版》(M27-A2)方案^〔5〕中的微量稀释法进行。 (4)结果判定^〔5〕:与对照孔比较,≥80%被抑制为M IC终点。 CLSIM27-A2推荐的M IC敏感度和耐药标准:氟康唑≤8 μg/mL,敏感(S);16~32μg/mL,剂量依赖敏感(S-DD);≥ 64μg/mL,耐药(R)。

挑取沙氏平板纯培养的氟康唑耐药株4 株、S-DD株2株和敏感株2株单菌落分别接种于3 mL液体发酵培养基(YEPD)中,37℃振荡培养过夜。

高保真酶Trans Hifi酶,核苷酸混合物(美国Trans公司)。以Lyticase酶破壁,按照酵母 DNA小量制备方案^〔6〕抽提热带假丝酵母菌基因组DNA。

以热带假丝酵母菌氟康唑敏感标准株ATCC 750的ERG11基因序列(基因序列数据库登录号为M23673)为模板,用Primer 5.0软件自行设计PCR引物,P1:5′-CAAGGTTTCTTGTTTATTATTTA-3′;P2:5′-AATAATGG- GATTTTTCTAGCTAC-3′,扩增CtERG11基因全序列,扩增片段大小为1 676 bp。

PCR产物纯化后测序,利用BioEdit软件及基因序列数据库BLAST程序将热带假丝酵母菌临床分离株(耐药株4株、S-DD株2株和敏感株 2株)的CtERG11基因序列与氟康唑敏感标准株ATCC 750 序列进行比对和分析。

142株热带假丝酵母菌中,128株对氟康唑敏感(S),占90.1%;4株为氟康唑剂量依赖(S-DD) 株,占2.8%,10株为氟康唑耐药(R)株,占7.1%。其中,2005年7月-2006年6月收集43株热带假丝酵母菌,氟康唑敏感率为93.0%,耐药率为4.7%;2006年7月-2007年6 月收集49株菌,氟康唑敏感率为91.8%,耐药率为6.1%; 2007年7月-2008年6月收集50株菌,氟康唑敏感率为 86%,耐药率为10.0%。

图 1

注:M: DNA Marker; 1 ～8: 热带假丝酵母菌42, 65, 58816, 59409, 58025, 58841, 53136和236菌株。 图 1 CtERG11基因PCR扩增电泳图

图 1可见,以热带假丝酵母菌基因组DNA为模板,CtERG11 P1、CtERG11 P2为引物,PCR扩增结果显示,产物大小为1 676 bp。

表 1

表 1 热带假丝酵母菌ERG11突变

表 1 热带假丝酵母菌ERG11突变

本研究结果显示,热带假丝酵母菌对氟康唑耐药率逐年升高,与国外报道^〔7〕一致,可能与使用氟康唑预防和治疗念珠菌病引起热带假丝酵母菌对氟康唑耐药相关。热带假丝酵母菌唑类药物耐药机制包括^{〔8, 9〕}:(1)氟康唑靶酶基因 CtERG11的突变和过表达;(2)外排泵基因的过度表达;(3) 生物膜的形成。CtERG11编码的羊毛甾醇-14α-去甲基化酶(14DM)是假丝酵母菌细胞膜麦角甾醇合成的关键酶。氟康唑能与14DM的活性位点结合,抑制真菌生长,而当 CtERG11点突变影响14DM空间构象时,会降低酶与药物的亲和力,导致耐药。本研究发现,敏感菌株无突变,S-DD和 R菌株中均有点突变,其中,核苷酸突变A242C、T243C、 G1362A和C1404T以及氨基酸突变D81A为首次发现,Y132 F和S154F与文献^{〔9, 10, 11〕}报道一致。由于14DM的活性位点在血红素远端,深埋于蛋白内部,底物需通过较长的进出通道才能到达^{〔12, 13〕}。三维分子建模软件分析表明,D81A、Y132F 和S154F分别位于底物进出通道的上方、通道内和通道开口,可能影响底物进入通道,导致14DM与氟康唑的亲和力下降,导致耐药。此外,研究表明,沉默突变虽不改变氨基酸序列但可能影响蛋白质与药物相互作用位点的结构^〔14〕。因此,CtERG11基因的沉默突变也可能与耐药有关。