目前,大肠癌在全世界范围内发病率位于恶性肿瘤的第 3位,并且以每年2%的速度上升。肌醇六磷酸(inos itol hexaphosphate,IP₆)是植物体内重要的含磷化合物,可以抑制多种肿瘤细胞系的生长,具有广泛的抗肿瘤活性^{〔1, 2, 3, 4, 5, 6〕}。本研究用不同浓度的IP₆以不同时间作用于人结肠癌HT-29细胞,观察IP₆对HT-29细胞凋亡的影响,从细胞、蛋白质、基因等水平探讨其抗癌机制。

人结肠癌细胞系HT-29(北京协和医科大学细胞库);IP₆(美国Sigma公司);DMEM/Ham F12培养基、 胎牛血清、胰蛋白酶(美国GIBCO公司);双标记流式细胞术 (Annexin V.F ITC/P I)双染试剂盒(中国晶美生物技术公司); Fura-2(美国Biotium公司);反转录试剂盒(美国Promega公司)。XDS-1B倒置显微镜(日本Olympus公司);JEM-1200EX 透射电镜、RF-540荧光分光光度计(日本JEOL公司);FACS Vantage流式细胞仪(美国BD公司);PCR仪(美国Biometra 公司)。

将HT-29细胞用含有5%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素、DMEM/Ham F12培养基培养至对数生长期,收获细胞进行试验。IP₆浓度分为0,1.8,和3.3 mmoL/L,作用时间分别为3 d,3,6个月,共9组。 每组3瓶细胞,浓度调整为1 ×10⁶个/mL。

收集细胞,2.5%戊二醛4℃固定4 h; 用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗细胞3次。1%锇酸4℃固定2 h,用PBS冲洗3次。乙醇梯度脱水。Epon812环氧树脂包埋,固化。超薄切片,醋酸双氧铀硝酸铅染色后透射电镜观察。

收集细胞,1 000 r/min离心5 min;用 100μL标记溶液重悬细胞,室温下避光孵育10 min;加入荧光溶液4℃孵育20 min;流式细胞仪激发光波长488 nm,515 nm检测F ITC荧光,560 nm检测P I。

收集细胞,调整细胞密度为 10⁷个/mL;37℃预温10 min,细胞悬液中加入3μL Fura-2,终浓度为3μmol/L;洗涤细胞并调整密度为3 ×10⁶个/mL。 参照Fura-2荧光法上机进行测定^〔6〕。

按照Trizol试剂说明书提取 RNA。反应体系及反应条件参照试剂盒说明书;反转录产物 -20℃保存备用。Caspase 3 PCR扩增反应体系25μL:10 × buffer 2.5μL,MgCl₂ 2μL,dNTP 0.5μL,Taq酶0.2 μL,上下游引物各1.5μL,cDNA模板3μL。反应条件:94℃预变性5 min,94℃ 30 s,52℃ 1min,72℃ 1min,循环35次;72℃充分延伸7 min。4℃浸润。扩增产物片段长度400 bp;β-actin反应体系及反应条件与Caspase 3相同,扩增产物片段长度152 bp。扩增产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳,紫外透射仪下观察结果,通过天能凝胶图像分析软件读取目的电泳条带斑点密度扫描值,每个样本均检测3次。将目的基因条带与β-action 条带的比值作为目的基因表达相对量。

采用SPSS 11.5软件进行分析,多组比较采用单因素方差分析,两两比较采用t检验。

经IP₆作用的HT2 29细胞出现凋亡现象,形态改变典型,染色体固缩,电子密度增高,细胞浆浓缩,细胞膜完成,表面微绒毛和伪足减少,可见凋亡小体,呈球形或月牙形,核膜消失、染色体断裂成碎片与细胞器等胞质成分聚集。

表 1

表 1 IP6对HT-29细胞凋亡速率影响( %, x ±s, n = 3)

表 1 IP6对HT-29细胞凋亡速率影响( %, x ±s, n = 3)

结果表明,与各时间段内的0 mmol/L组比较,经IP₆作用后,HT-29细胞凋亡率均升高 (P < 0.05);其中IP₆作用6个月时间组与对照比较,差异有统计学意义(P < 0.01)。

表 2

表 2 IP6对HT-29细胞内钙浓度的影响(nmol/L, x ±s, n = 3)

表 2 IP6对HT-29细胞内钙浓度的影响(nmol/L, x ±s, n = 3)

各IP₆作用组 Ca²⁺浓度均升高(P < 0.05),其中IP₆以3.3 mmol/L作用3 d,3,6个月后,Ca²⁺浓度随作用时间的延长而升高,差异有统计学意义(P < 0.05)。

图 1

注: 1: DNA marker; 2: 0 mmol/L 3 d; 3: 1.8 mmol/L 3 d; 4: 3.3 mmol/L 3 d; 5: 0mmol/L 3个月; 6: 1.8 mmol/L 3个月; 7: 3.3 mmol/L 3个月; 8: 0 mmol/L 6 个月; 9: 1.8 mmol/L 6 个月; 10: 3.3 mmol/L 6个月。 图 1 IP6 对HT-29细胞Caspase-3 mRNA表达影响

与对照组比较,各IP₆作用组caspase-3 mRNA表达均升高(P < 0105),其中,与3 d和3个月组比较,6个月组Caspase-3mRNA 表达升高(P < 0.01);IP₆作用3 d和3个月的组间差异无统计学意义(P > 0.05)。

IP₆对多种肿瘤细胞系具有良好抑制作用,包括恶性胶质瘤细胞系^〔1〕、宫颈癌细胞系^〔2〕、前列腺癌细胞系^{〔3, 4, 5〕}和 HepG2肝癌细胞系^〔6〕。研究表明,IP₆以不同浓度(0~13.0 mmol/L)持续作用HT-29细胞2~6 d,对结肠癌细胞系生长具有浓度依赖性和时间依赖性抑制作用^{〔7, 8〕}。细胞凋亡与肿瘤的发生、发展及退化密切相关。各种诱导因素作为细胞凋亡发生的第一信号系统,与细胞内受体结合,刺激细胞内第二信号系统,如Ca²⁺、cAMP等促进凋亡基因表达,引发第三信号系统即线粒体跨膜电位与线粒体通透性改变以及caspase 系统激活,最终导致细胞凋亡^〔9〕。通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspases是细胞凋亡信号传导的主要途径之一^{〔10, 11〕}。

IP₆对HT-29细胞凋亡的促进作用可能是通过调控细胞信号转导,调节相关凋亡基因表达来实现的。IP₆及其次级磷酸化形式可以促进HT-29细胞内Ca²⁺浓度增高,从而引发钙超载介导的细胞凋亡活动,其中包括激活caspase家族非活化酶原,引起caspase-3级联放大效应,可能导致细胞内一系列蛋白底物裂解作用,促进HT-29细胞凋亡发生,发挥抗结肠癌的作用。