肠道病毒是一组无包膜单链RNA微小核糖核酸病毒,主要由脊髓灰质炎病毒1-3型、柯萨奇病毒A1-23型,柯萨奇病毒B1-6型等组成^{〔1, 2, 3〕}。大多数肠道病毒感染是温和的或亚临床型的,病程发展可经过几个星期,极少数病例可导致严重疾病甚至死亡^{〔4, 5〕}。对疾病进行快速诊断有助于及时处理病情,病人早期治疗^〔6〕。目前,肠道病毒的检测方法主要包括电镜、病毒分离鉴定、血清分型、中和抗体和RT-PCR等。本研究应用TaqMan技术建立了一种快速诊断肠道病毒核酸的荧光定量RT-PCR方法,特异性好,灵敏度高,方法操作简便。为研究肠道病毒早期快速诊断试剂盒做好肠道病毒的监测提供依据。

One Step PrimeScrip tT^M RT-PCR Kit[宝生物工程(大连)有限公司);High Pure Viral RNA Kit (上海罗氏制药有限公司);Two Step RT-PCR[宝生物工程(大连)有限公司];T Easy Vector[普洛麦格(北京)生物技术有限公司];Q IAquick Gel Extraction Kit (德国Q IAGEN生物技术公司);Cycle-Pure Kit (美国OMEGA公司);Plasmid Mini Kit Ⅰ(美国OMEGA公司);Taq酶[宝生物工程(大连)有限公司]。

灭活的脊髓灰质炎病毒PolioⅠ、PolioⅡ、 PolioⅢ(广东省疾病预防控制中心);EV71、CA16、柯萨奇 A24、轮状病毒、诺沃克病毒、(非洲绿猴肾细胞)(VERO)(深圳市疾病预防控制中心微生物检测中心);E coli JM109感受态细胞[宝生物工程(大连)有限公司]。粪便标本:2006年的 1月-12月,收集深圳市手足口病等肠道病毒疑似病例粪便标本89份。

根据肠道基因序列进行序列比对分析,设计引物和探针:上游引物:EVF:5′-CCCTGAATGCGGCTA2 ATCC-3′;下游引物:EVR:5′-ATTGTCACCATAAGCAGCCA -3′;TaqMan探针:EV Probe:5′FAM-AACCGACTACTTT2 GGGTGTCCGTGTTTC-TAMRA 3′。该对引物的扩增片断长度为144bp。在美国国立生物信息技术中心数据库(NCB I)上进行序列同源性比对验证,引物系列同源性好。探针的5′端用FAM荧光基团标记,3′端用TAMRA淬灭集团标记。引物和探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成。

200μL病毒培养液提取RNA,用High Pure Viral RNA Kit提取,将提取的RNA做好标记,保存于- 80℃冰箱,备用。

选用EV71标准株为代表构建质粒。取PCR产物与pGEM-T Easy Vector进行连接,在 16℃连接5 h。构建原核融合表达载体。迅速将连接产物转化入Ecoli JM109感受态细胞内,再将转化菌倒在氨苄青霉素平板上,37℃培养过夜,进行蓝白斑选择,转化成功的均呈白色。用灭菌牙签挑取白色阳性单个菌落接种到液体培养基中,37℃振荡过夜。取1.5 mL菌液用PlasmidMini Kit Ⅰ提取重组质粒DNA。在1.5%琼脂糖凝胶上进行重组质粒鉴定,结果显示,均出现目的条带,说明成功地构建了目的质粒。将质粒保存在-20℃,用做阳性标准品。

经条件优化后的反应体系为:25μL反应体系,分别包括:2 ×One Step RT-PCR Buffer 12.5μL,TaKaRa Ex Taq HS 0.5μL,PrimeScript RT EnzymeMix 0.5 μL,EVF 200 nomL/L,EVR 200 noml/L,EV Probe 120 noml/L,RNA 2μL,dH2O 7.5μL,一共25μL。反应条件为:42℃ 5 min,逆转录→ 95℃ 10 s,灭活95℃ 5 s,60℃ 40 s,扩增共45个循环。采用MX 3 500荧光定量 PCR仪进行PCR扩增,延伸阶段收集单点荧光。

选择实验室保存的PolioⅠ、PolioⅡ、Polio Ⅲ、EV71、CA16、CA24重要肠道病毒标准株做阳性标准进行检验,选择同样会引起肠道感染的轮状病毒和诺沃克病毒和水参进行特异性阴性检验。

选用构建的 EV71标准质粒建立定量标准曲线。用双蒸水将提取的质粒稀释,在核酸定量仪上测定其在260和280 nm处的吸光度 (A)值,计算其拷贝数/μL。用无菌水进行10倍倍比稀释,用于构建标准曲线,稀释成5个浓度点,分别为:5.78 ×10⁸,5. 78 ×10⁷,5.78 ×10⁶,5.78 ×10⁵,5.78 ×10⁴拷贝/μL。用上述稀释的5个浓度为模板并设阴性对照,用建立的荧光定量RT -PCR反应体系及反应条件绘制定量标准曲线。以模板浓度为横坐标,循环的Ct值为纵坐标绘制曲线。

取一个单位的细胞单数致死量(TCID₅₀)的病毒培养液进行10倍倍比稀释,稀释成8个稀释度,分别为5.023 ×10⁷~5.023 ×10⁰ TCID₅₀。取稀释好的200μL病毒液提取病毒RNA,提取方法同上。用提取好的RNA做阳性模板同时设阴性对照,用建立的荧光定量RT-PCR绘制灵敏度标准曲线。以模板浓度为横坐标,循环的Ct值为纵坐标绘制曲线。

分别用建立的荧光定量RT-PCR和普通RT-PCR对89例肠道病毒感染患者的粪便标本进行检测。

经建立的体系检验,所有PolioⅠ、PolioⅡ、PolioⅢ、EV71、CA16、CA24标准株均观察到荧光信号增强,阳性率100%。轮状病毒、诺沃克病毒和阴性对照均未观察到荧光信号增强,结果为阴性。阳性标准和阴性标准无交叉反应。表明所建立的方法具有高特异性,无假阳性结果。

图 1

图 1 肠道病毒共引物荧光RT - PCR特异性分析

用EV71标准质粒10倍倍比稀释成5个浓度的标准模板,以初始模板量的对数为横坐标,Ct值为纵坐标,计算机自动绘制标准曲线。初始模板浓度与Ct值之间呈较好的线性关系。本体系的最低检测限为105拷贝/μL,扩增的标准曲线为Y=-3.474X +53.67,曲线的斜率为-3.474,在Y轴截距为53.67,相关系数R²=0.999,说明各个浓度的相关系数非常好。PCR的扩增效率为94%,说明PCR反应对模板的扩增完全。

采用TCID₅₀分析灵敏度,选EV71标准株为代表株。根据EV71的TCID₅₀稀释成8个稀释度,分别为5.023 ×10⁷~5.023 × 10⁰ TCID₅₀。标准病毒等比例稀释液实时荧光RT-PCR结果呈现规律的Ct值变化,扩增曲线线性较好,表明仪器参数稳定。

图 2

图 2 　肠道病毒共引物荧光RT - PCR EV71 TC ID50模板灵敏度标准曲线

以已知病毒的TCID₅₀浓度为横坐标,荧光RT-PCR的Ct值为纵坐标,计算机自动绘制灵敏度标准曲线。本体系检测到的最低浓度为5.0 TCID₅₀,当浓度为5.023 ×10⁰ TCID₅₀时无荧光信号。建立的标准曲线为:Y=-3.230X+16.36,曲线的相关系数R²=0.991,曲线斜率为-3.230,在Y轴截距为16.36,说明各个浓度的相关系数非常好。PCR扩增效率为104.0%,说明PCR反应对模板的扩增完全。建立的荧光定量RT-PCR方法检测限低,比普通方法检出率高,具有高灵敏度特点。用于筛选效果好。

用所建立的方法对89份手足口病等肠道病毒感染疑似病例临床粪便标本进行检验,并与传统的RT-PCR进行比较,传统的RT-PCR选用EV71和CA16特异性引物进行扩增。本方法检出72份阳性结果,检出率为 80.9%。传统的RT-PCR检出56份手足口病株,检出率为 62.92%。得χ²值为29.3,P<0.05,差异有统计学意义。

目前,肠道病毒诊断的金标准是病毒分离培养。但病毒培养耗时长,需要大量病毒组织液,检验的敏感度不高,且细胞培养不能分离某些病毒株^〔7〕。普通RT-PCR针对病毒基因检测,提高了特异性及灵敏度,但其操作繁琐,容易造成污染,出现假阳性。

本研究利用TaqMan技术建立的荧光定量RT-PCR检测肠道病毒方法,对Polio Ⅰ、Polio Ⅱ、Polio Ⅲ、EV71、CA16、 CA24等6个阳性标准株进行检验均呈阳性,荧光信号值增强,同样能引起肠道疾病的轮状病毒、诺沃克病毒及阴性对照等呈阴性,无荧光信号值增强,均无交叉反应。用质粒模板 10倍梯度稀释建立的标准曲线,最低检测浓度为10⁵拷贝/μL。用TCID₅₀ 10倍倍比稀释成8个浓度建立灵敏度标准曲线,检测到的最低检测限为5.0 TCID₅₀。用本方法对临床标本进行检验,检出率为80.9%,明显高于传统的RT- PCR的检出率62.92%。本研究建立的方法具有特异性好灵敏度高与临床结果符合性好的特点,可以在2 h内快速高通量地对标本进行筛选,用于日常疑似肠道病毒感染标本的筛检工作。