灵敏、准确的DNA定量方法在生物学研究及应用领域中发挥着重要的作用,尤其对痕量DNA定量时。根据2005版《中国药典2005版(三部)》检测外源DNA含量采用的是Southern blotting杂交法^〔1〕,此法可以检出pg水平的DNA^〔2〕,但其是半定量的方法。荧光定量法是一种灵敏的DNA定量方法,将荧光染料与DNA结合,利用荧光分光光度计采集结合后增强的荧光信号,通过DNA标准样品计算得出样品DNA的浓度。本研究基于SYBR Green I荧光发光原理,通过对DNA抽提方法的改进来提高抽提制品时痕量DNA回收率,以建立一种痕量DNA检测方法。 1 材料与方法 1.1 样品

狂犬疫苗(华兰生物疫苗有限公司)。

1.2 试剂和仪器

Pro te in prec ipita tion solution和DNA H y- dration so lution (为PuregeneCe ll and TissueK it中的2种成分) (德国Qiag en公司);DNA检测试剂盒(瑞士Roche公司); SYBR Green I (美国Inv itrogen公司);糖原(Glycogen)(碧云天 生物技术研究所);饱和酚(生物纯)(北京市双翔达生化试剂 仪器经营部);蛋白酶K、RNA酶(Rnase)﹑三羟甲基氨基甲 烷(Tris)﹑异丙醇和十二烷基硫酸钠(SDS)(美国Sigm a公 司);乙二胺四乙酸二钠溶液(EDTA)(天津市化学试剂三 厂);HCl (洛阳昊华化学试剂有限公司);马来酸(北京惠泽奥 公司);无水乙醇(天津市科密欧化学试剂有限公司);多功能 酶标仪V arioskan Flash (美国Therm o公司);3-18K高速台式 离心机(德国赛多利斯公司);紫外交联仪(新芝科技股份有 限公司);电热恒温水浴箱(上海申贤恒温设备厂);H2- 2011KC气浴培养摇床(大仓市科教器材厂);MFS-%多功能三维旋混仪(深圳盘西诺生物科技有限公司);XW-80A旋 涡混合器(上海医大仪器厂)。

1.3 试剂制备

(1)2%蛋白酶K溶液:称取蛋白酶K 0.20 g,溶于灭菌水10 mL,分装后储藏于-20℃备用。(2)3%牛 血清白蛋白溶液:称取牛血清白蛋白0.30 g,溶于灭菌水10 mL中。(3)1mol/L Tris溶液(pH 8.0):用盐酸调pH至8.0, 高压蒸汽灭菌。(4)5.0 mol/L氯化钠溶液:高压蒸汽灭菌。 (5)0.5 mol/L EDTA溶液(pH 8.0):用10 mol/L NaOH调pH 至8.0,高压蒸汽灭菌。(6)20% SDS溶液:用浓盐酸调pH 至7.2。(7)蛋白酶K缓冲液(pH 8.0):量取1 m ol/L Tris溶 液(pH 8.0)1.0 mL,5.0 mol/L氯化钠溶液2.0 mL,0.5 mol/L EDTA溶液(pH 8.0)2.0mL,20% SDS溶液2.5 mL,加灭菌水 至10mL。(8) Tr is-乙二胺四乙酸缓冲液(Tris-EDTA,TE):取1 mo l/L Tris溶液(pH 8.0)10 mL,0.5 mo l/L EDTA溶液(pH 8.0)2 mL,加灭菌水至1000 mL。

1.4 传统DNA抽提方法 1.4.1 蛋白酶K预处理

500 μL样品加入55 μL蛋白酶缓 冲液,5 μL蛋白酶K (20mg/mL),混合后37℃保温4 h~以 保证酶切反应完全。

1.4.2 饱和酚抽提及乙醇洗涤沉淀

加入饱和酚溶液 600 μL,剧烈混合,10000 r/m in离心10 min。转移上层液体, 加入3 mol/L醋酸钠溶液(pH 5.2)20μL,充分混合,再加入 -20℃以下的无水乙醇400 μL,充分混合,-20℃以下过夜 后,15 000 r/min离心15 min。用150 μL-20℃ 70%乙醇洗 涤沉淀1次,15 000r/m in离心15 min,弃上清液,保留沉淀, 吹至干燥后,加100 μL灭菌TE缓冲液溶解。

1.5 改进DNA的抽提方法

500 μL样品加入10 μL 20% SDS,10μL 0.5 mol/L Tris-HCl (pH 8.0),15μL蛋白酶K (20 mg/mL),颠倒混匀25次,55℃孵育3 h;加入6μL Rnase (10 mg/mL),颠倒混匀25次,37℃孵育1 h;加入167μL Pro- tein Prec ip itation So lution,高速漩涡震荡20 s,冰浴10 min,16 000 g离心5 min,离心后放置于冰浴中,取上清液;取500μL 异丙醇和0.5 μL G lycogen到一个新的1.8mL Eppendo rftube,加入适量(620 μL)去除蛋白质的离心上清液,颠倒混匀 50次,-80℃放置2 h,16000g离心30 min,弃上清;沉淀中 加入500μL 70%乙醇,颠倒混匀10次,16 000g离心10 min; 弃上清,静置15~30 min,待乙醇挥发尽;加入100 μL DNA H ydration so lu tion,中速漩涡5 s,65℃孵育1 h,室温轻微震荡 过夜,充分溶解DNA,6 000 r/m in离心30 s,保存备测。

1.6 DNA测定 1.6.1 荧光法^〔3,4〕.用TE将已知DNA浓度稀释成标准系列

(400,200,100,50,25,12.5,6.25,3.125,1.56,0.78,0.39,0.2 和0 ng/mL),样品稀释一定的倍数,于96孔荧光微量滴定板 内分别加100 μL标准和样品稀释液,每孔再加100 μL用TE 稀释10 000倍的SYBR GreenI混合,避光静止15 min。用多 功能酶标仪Var ioskan Flash在激发光为485nm,发射光为 518 nm下测吸光度(A)值。每个标准和样品做2孔。计算每 标准和样品的A值,即A=(A测定1+A测定2)/2,以标准 DNA各浓度的吸光值为横坐标(X轴),以相应的浓度为纵坐 标作图得标准曲线,然后将样品的吸光度值在标准曲线求出 相应的Y值,则原样品DNA的浓度(ng/mL)=y×稀释倍数/ 5。

1.6.2 Southern blotting杂交

按文献^〔2〕.中杂交方法处理硝 酸纤维素膜,并用点样器点样,待检及已知浓度的DNA对照 样品均先用沸水煮10 min变性,迅速冷却,20μL点样。室温 晾干膜,紫外线照射膜5 min,然后进行预杂交(杂交(洗膜 (封闭(加抗体(洗膜(显色(终止反应观察记录结果。由 于采用的500μL体系抽提样品DNA,用100μL DNA Hydra- tion so lution去溶解DNA,在点膜前根据样品DNA进行适当 的稀释,点膜用20 μL,故原样品DNA的浓度(ng/mL)=膜上 直读样品DNA浓度×10×稀释倍数。

1.6.3 抽提率计算

抽提率=(抽提后样品DNA的含量/抽 提前样品DNA的含量)×100%。

2 结 果 2.1 SYBR Green I工作浓度选择

将SYBR GreenI分别稀释为1:1 000,1:10 000,1:100 000制作DNA标准曲线(DNA 浓度分别为1 600,800,400,200,100,50,25,12.5,6.25, 3.125,1.56,0.78,0.39,0.2和0 ng/mL)。1:1 000稀释度 DNA浓度在3.125~1 600 ng/mL时相关系数的平方(R2)达 到0.999 1;1:10 000稀释度DNA浓度在1.56~1 600 ng/mL 时R2达到0.999 9;1:100 000稀释度DNA浓度在0.78~400 ng/mL时R 2达到0.999 1。由此可知荧光染料在1)10 000稀 释度线性范围比1:1 000稀释度广,这样可以节约成本,效果 更好。荧光染料在1:100 000稀释度时虽然灵敏度高,但线 性范围窄,故选择荧光染料1:10 000稀释度。

2.2 荧光法和蛋白印迹(Southern blotting)杂交法比较

将4个样品经改进的方法抽提后同时经荧光法和Southern blotting 杂交法检测DNA浓度(ng/mL)。在Southe rnblotting杂交法 时根据样品DNA浓度进行稀释后点膜。由于Southern blotting法是半定量的,只能根据它的颜色与哪个标准点比较接 近来进行判读,不能具体读出DNA含量。Southern blotting杂 交的结果分别约为0.3,3,100和300 ng/mL;荧光法的结果分 别为0.38,6.92,76.5和296 ng/mL。Southe rn b lo tting结果和 荧光检测结果基本可以相互印证。

2.3 样品抽提时加入SDS

与Tris-HC l对抽提结果的影响将2批样品各分为2组(每组抽提3管)进行抽提,其中一组 在抽提时不加SDS与Tris-HC,l另一组则加入SDS与Tris- H C,l经荧光法检测加SDS与Tris-HCl结果分别为(54.2± 0.5)和(54.3 ± 0.6) ng/mL;不加SDS与Tris-HCl结果分别 为(21.2 ±7.6)和(19.3 ± 8.2) ng/mL。抽提时加入SDS与 Tris-HCl可以明显增加抽提效率。

2.4 样品抽提时加入Glycogen对抽提结果的影响

将2批样品各分为2组(每组抽提3管)进行抽提,其中一组在抽提 时不加G lycogen,另一组则加入Glycog en,经荧光法检测加 G lycogen的结果分别为(54.6±0.5)和(54.0±0.6) ng/mL; 不加Glycogen的结果分别为(26.3±7.5)和(29.3±8.3) ng/ mL。加入Glycog en结果稳定,回收率高。

2.5 痕量样品DNA抽提方法比较(表1)

500 μL TE中分 别含1 000,100,10,1 ng DNA,用2种方法抽提,根据荧光法 测定抽提后的DNA的浓度。根据抽提率的计算公式计算,改 进的方法抽提回收率为73%~86%;而传统的方法抽提回收 率为8%~12%。传统方法稳定性和回收率明显低于改进方 法。

3 小 结

若样品中DNA含量很低,而荧光检测时灵敏度达不到。 本法抽提DNA起到了浓缩的作用,样品中的DNA经过浓缩 后可以达到荧光检出的水平。荧光法和Southern blotting杂 交法比较,更快速、精度更高。荧光法检测只需30 m in,而 Southern blotting杂交法需要2 d。Southern b lotting杂交法只 是半定量的方法,荧光法可以根据DNA的标准曲线准确读出 DNA的浓度。因此,本方法可作为检测痕量DNA手段。 SDSμ5.是离子型表面活性剂。Tris-HCl的作用是维持一 个比较稳定的pH环境。Glycogen可以用作沉淀DNA或RNA 的辅助沉淀剂。所以在抽提过程中加入SDS、Tris-HC l及G lycogen有利于提高并稳定DNA的回收率。