氯乙烯单体(vinyl chlori demonomer,VCM)是生产聚氯乙烯的化工原料。研究表明,氯乙烯是一种遗传毒性致癌物,其致癌机制与遗传物质受损有关^{〔1, 2〕}。P53基因可接受遗传物质受损的信号,激活其下游基因p21,对细胞周期起负调控作用。当细胞受到DNA损伤刺激时,P53蛋白表达量迅速升高。有研究发现,多种致癌物可使P53蛋白表达过量^{〔3, 4〕}。氯乙烯暴露人群外周血P53蛋白表达也呈增高的态势^{〔5, 6〕}。但这种过表达是由于P53蛋白降解减少还是m RNA表达水平的增高引起的尚不明确。本研究测定了VCM暴露人群中 P53基因mRNA的表达水平,为探讨VCM的致癌机制提供科学依据。

从上海某氯碱化工厂接触VCM工人中,选择 VCM接触超过1年、并完整填写调查表及抽取血样的工人为暴露组。共获得符合条件的对象75名,其中男性40名,女性 35名,年龄为22~54岁,累计接触剂量为614~301 992 mg。以无VCM以及其他毒物接触史的本地志愿者为对照人群,共 43名。按累积接触剂量中位数将暴露组人群分为高接触组和低接触组。2组工人的性别、年龄、吸烟和饮酒情况均衡可比。

在获得知情同意的情况下,抽取每个研究对象肘静脉血2 mL,置抗凝管中轻轻混匀,立即放入冰盒内保存,4 h内运送至实验室进行外周血中淋巴细胞分离。采用氯仿、异丙醇抽提法从淋巴细胞中提取总RNA。紫外分光法测定RNA纯度和含量。

用RevertA id第一链合成试剂盒将RNA模板逆转录成cDNA。Real-tim e PCR嵌合荧光法(SYBR Green I染料法)检测基因mRNA表达量。从Genbank中获得P53基因mRNA序列,应用Pr im er Prem ier 510软件进行引物设计,其中P53基因上游引物为:TCTGACTGTACCACCATCCACTA,下游引物为:CAAACACGCACCTCAAAGC,扩增片断长度为146 bp;内参基因(GAPDH)上游引物为::AGGGCTGCTTTTAACTCTG,下游引物为:CTG GAAGATGGTGATGGG,扩增片断长度为 177 bp。Rea-l tim e PCR反应体系为10 LL,每个样品做3个平行样,在PRISM AB I 7900HT上进行PCR扩增。P53基因的表达采用相对定量^〔7〕,基因的表达量用2^{-ΔC t}表示,其中ΔCt =Ct_q-Ct_cb (Ct_q为目的基因的Ct值,Ct_cb为内参基因的Ct值)。 1.4个人累积接触剂量计算以及P53基因分型

个人累积接触剂量以及P53基因3个多态位点,包括Arg72Pro (rsl042522),Intron3(rsl7878362),IVS6 A %gt; G (rs1625895)。基因型分析方法按文献^〔8〕。

采用SAS V ersion9. 1软件进行统计分析。2组人群一般情况的比较采用t检验和x²检验。经正态性检验,P53mPNA表达分布为非正态分布,因此,用中位数(上四分位数,下四分位数)表示。2组基因表达的比较采用稳健线性回归分析。采用M ann-W hitney和K ruska-lW allis检验分析暴露剂量和基因型与表达量关系。

2.1研究人群的一般情况

暴露组男性为40人,女性为35人;对照组男性为15人,女性为28人。暴露组吸烟人数为28人,占总人数的36. 4%;对照组吸烟人数为14人,占总人数的32.6%。暴露组饮酒人数为13人,占总人数的16. 9%;对照组饮酒人数为12人,占总人数的27.9%。V2检验,人群性别比例以及吸烟、饮酒率差异均无统计学意义(P > 0. 05)。但暴露组年龄小于对照组,分别为(35.53±5.57)和(45.41±5.97)岁(P < 0.05)。

P53和GAPDH的融解曲线呈单峰,cDNA解链温度分别为83.5和82.3℃。暴露组和对照组P53mRNA相对表达量(用 2^{-ΔC t}×10²表示)分别为0.467 4(0.097,1.816)和1.640 (0.960,2.680),经稳健多重回归分析去除年龄的影响因素,结果2组表达量差异有统计学意义(P < 0.05)。

表 1

表 1 2组P53基因mRNA表达稳健多重回归分析

表 1 2组P53基因mRNA表达稳健多重回归分析

VCM高接触组和低接触组P53相对表达量的中位数(上四分位数,下四分位数)分别为0.692(0.092,1.993)和0.393(0.098,1.801)。M ann-Wh itney检验结果,z=-0.043,P=0.966,2组P53基因表达差异无统计学意义。

按P53基因3个多态位点的基因型进行分组,因P53 Intron3未检测到突变纯合子,仅分2组;P53 Intron6仅检测到1例突变纯合型,故将其与杂合型合并。P53A rg72Pro 3种基因型P53 mRNA表达经K ruska l-W allis检验,x²=4.230,P=0.121,差异均无统计学意义(P > 0.05)。P53 Intron3和P53Intron6基因型 P53mRNA表达经Kruskal-W allis检验,z值分别为-0.091和-1.309,P值分别为0.928和0.190。

表 2

表 2 P53基因型与mRNA 表达的关系(2-△Ct×102)

表 2 P53基因型与mRNA 表达的关系(2-△Ct×102)

通常情况下,在暴露于致癌物发生DNA损伤时,机体内 P53蛋白的量增加,启动多种下游基因转录,如p21、M dm 2和 Bax,在G1/S检查点延缓了细胞周期,使细胞有足够的时间进行修复。VCM是一种遗传毒性致癌物,因此,VCM暴露可能会引起机体P53蛋白表达增加。已有研究表明,在VCM暴露工人中,其外周血P53蛋白量增加^{〔5, 6〕}。但本次研究发现,VCM暴露工人外周血P53mRNA表达量降低。分析原因可能是VCM导致DNA损伤后启动P53依赖的修复途径,P53蛋白量降解减少,从而使P53蛋白蓄积^〔7〕,反馈抑制了 P53mRNA的表达。因此,推测VCM暴露工人外周血P53蛋白量增加可能是由于P53蛋白量降解减少引起的,而不是通过增加mRNA水平表达引起的,有待进一步研究。最近有研究发现,肾细胞癌患者的肿瘤组织中P53mRNA的表达量明显低于非肿瘤组织^〔10〕。因此,VCM暴露工人外周血 P53mRNA表达量降低是否可以作为一个早期损伤的生物标志物,也需要进一步研究。

本研究还发现,VCM暴露工人P53基因表达与累积接触剂量无明显的剂量效应关系,可能与该人群整体接触的VCM浓度均较低,VCM在体内能够及时代谢有关。分析P53基因 3种多态位点基因型与其mRNA表达的关系显示,3个位点的突变均使P53mRNA表达量增加,尤其是P53Intron6突变型 mRNA表达高于野生纯合型5倍左右,但由于样本例数较小,差异无统计学意义。今后应加大样本例数,以确定P53基因多态与其mRNA表达量之间的关系。