乙型肝炎病毒(HBV)是引起急、慢性肝炎的主要病因,并且与原发性肝癌的发生密切相关^〔1〕。故寻找有效的抗 HBV药物是当务之急。近年来,中医药治疗乙肝渐成热点^〔2〕,但尚缺乏研究依据。人肝癌细胞株(HepG)2215细胞是能够表达HBV抗原和分泌完整HBV颗粒的肝胚瘤细胞系,为抗HBV药物的筛选提供了基础物质^〔3〕。本研究利用 HBV的体外增殖系统2215细胞系对多种中药提取物进行了抗HBV活性观察。

以带有HBV-DNA全基因组的重组质粒转染人肝癌细胞株(HePG2)获得,能向培养上清中稳定地分泌HBsAg、HBeAg和完整HBV颗粒。(武汉大学保藏中心)。

MEM培养液,胎牛血清(美国GIBCO公司);HBsAg、HBeAg EL ISA检测试剂盒(上海科华生物有限公司);培养板,96孔板,24孔板(美国Corning公司);二氧化碳孵箱(美B IO-tec公司)。

本实验室自制:分别称取单味中药 20 g,加蒸馏水浸泡30 min后,再加蒸馏水于高出药材2~3 cm,用武火煎至微沸,再以文火煎煮30 min,将药液用4层纱布滤出;重新加蒸馏水至药材表面,用武火煎至微沸,再以文火煎煮30 min,将药液用4层纱布滤出;合并上述2种滤出液,再将药液浓缩至20 mL左右,冷却后加食用酒精20 mL左右,过夜,过滤,滤液蒸馏,得无食用酒精的药液,调pH 7.2~ 7.4,稀释至20 mL,消毒,冰冻离心沉淀,4℃保存备用。药液生药含量为1 g/mL。按照此方法煎制香薷、鬼箭羽、苦参、黄连、穿心莲、连钱草、茜草、莲子心、锁阳、金荞麦、紫苏叶、黄芩、胡黄连、栀子、桑葚、佩兰、石榴皮、黄芪、女贞子、吴茱萸、生麻黄、辣廖、肿节风、棉花根、山豆根、使君子、地耳草、木瓜、甘草、党参共30味药,最终生药浓度为1 g/mL。30味药分别用EL ISA方法进行HBsAg、HBeAg检测。

参照文献〔4〕。

中药提取物(1 g/mL)用培养液2倍稀释成7个终浓度:100,50,25,12.5,6.25,3.125,1.56 mg/mL,加入96孔细胞培养板,每浓度3孔,每孔20μL,培养 4 d,观察药物对细胞的毒性,设空白细胞对照。由于药液颜色深,采用显微镜观察细胞病变(CPE)^〔5〕。病变程度分5级:完全圆化变形为5,病变75%为4,病变50%为3,病变25%为2,无病变为1。

每10万个/mL 2215细胞接种24孔细胞培养板,每孔0.9 mL,37℃ 5% CO₂培养24 h。加无毒浓度以下2倍稀释试验药液,3个稀释度,每浓度3孔,37℃ 5% CO₂培养第4 d收取培养液,测定HBsAg和 HBeAg。实验设HBsAg、HBeAg阳性和阴性对照、细胞对照和空白对照。

EL ISA检测试剂盒测定,方法按说明书。

(1)抗原抑制百分率=(细胞对照A值-药物A值)/(细胞对照A值-空白对照A值);(2)半数有效浓度(IC50);半数有毒浓度(TC₅₀);最大无毒浓度(TC₀) (3)治疗指数(SI):SI=TC₅₀/IC₅₀,SI > 2为有效,1 < SI < 2有毒有效,SI < 1为毒性作用;(4)判定标准:抑制率< 30%为无效、30%~50%为有轻度抑制、> 50%为有明显抑制作用。

表 1

表 1 　6味中药提取物对2215细胞分泌HBeAg 4 d后抑制作用

表 1 6味中药提取物对2215细胞分泌HBeAg 4 d后抑制作用

表 2

表 2 18味中药提取物对2215细胞分泌HBsAg 4 d后抑制作用

表 2 18味中药提取物对2215细胞分泌HBsAg 4 d后抑制作用

实验结果表明,中药提取物在2215细胞培养中对HB2 _sAg、HBeAg表达作用,随着中药提取物浓度的增加,其抑制作用增强,抑制率增加。HBV DNA克隆转染人肝癌细胞(Hep G2)的2215细胞系,经自行传代培养,能长期稳定地向培养上清中分泌HB_sAg、HBeAg和HBV颗粒,是体外抗HBV药物筛选的很好模型。30味中药从清热解毒药及补气药中选取。本实验室采用的乙醇提取方法制备的药液含杂质少,减轻了对细胞的危害。结果显示,在30味中药提取物对2215细胞的抑制实验研究中,18味中药提取物对抑制HBsAg的分泌作用明显,最高抑制率可达89.7%;6味中药提取物对抑制 HBeAg的分泌作用明显,最高抑制率为73.6%;6味中药提取物对抑制HB_sAg、HBeAg作用明显,治疗指数均> 2,为有效低毒的药物。其中石榴皮在最高无毒浓度(TC0)为25 mg/mL时,对HBsAg、HBeAg平均抑制率分别为82.07%和73.6%,地耳草在最高无毒浓度12.5 mg/mL时对HBsAg、HBeAg平均抑制率分别为71.2%和72.6%等,抑制作用十分明显。甘草、木瓜、党参对2种抗原的抑制作用均不明显。其他药物对 2种抗原有一定抑制作用,但因毒性过强,还有待研究。