溴苯腈( brom o xyn il),化学名3,5- 二溴- 4- 羟基苯甲腈,是一种具有传导活性的选择性苗后茎叶处理触杀型除草剂。有研究表明,二巯基丙磺酸钠( Na-DM PS )、N-乙酰-L-半胱氨酸( NAC ) 等巯基化合物对小鼠溴苯腈急性中毒有一定保护作用,尤其是两者联用疗效更佳,可减轻小鼠中毒症状,明显提高存活率^〔1〕。本研究旨在检测Na-DM PS、NAC 对小鼠溴苯腈急性中毒时脑组织腺苷酸含量及钠钾腺苷三磷酸酶 ( N a⁺ -K⁺ -ATPase )、钙镁腺苷三磷酸酶( C a²⁺ -M g²⁺ - ATPase)活性改变的影响,探讨其对小鼠溴苯腈急性中毒脑组织的保护作用。

标准品三磷酸腺苷( ATP)、二磷酸腺苷( ADP) 、一磷酸腺苷( AM P)、二甲基亚砜(美国S igm a 公司); 97%溴苯腈原药(浙江禾本农药化学有限公司); N- 乙酰半胱氨酸泡腾片( 意大利赞邦公司); 二巯基丙磺酸钠( 上海禾丰制药有限公司) ; Na⁺ -K⁺-ATPase、Ca²⁺ -M g²⁺ -ATPase 测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。Ag ilent1100 型高效液相色谱仪(美国Ag ilent公司); 高速低温离心机( 美国 B eckm an公司); 722型分光光度计(上海分析仪器二厂) 。

ICR小鼠40只(温州医学实验动物中心),体重( 20 ± 2) g,雌雄各半。

97%溴苯腈原药以10% 二甲基亚砜 ( DM SO)为溶媒配成浓度10 mg /mL 溴苯腈灌胃液待用。实验关动物禁食12 h,不禁水,随机分成5 组,每组8只。正赏对照组给予10% DM SO 溶液( 20 mL /kg )灌胃; 急性中毒组给予溴苯腈( 200 mg /kg ) 灌胃染毒; NAC 组给予溴苯腈( 200 m g /kg )灌胃染毒后,即刻给予NAC ( 300 mg /kg ) 灌胃; Na- DM PS组给予溴苯腈( 200 mg /kg )灌胃染毒后,即刻给予Na- DM PS( 300 m g /kg) 腹腔注射; Na-DM PS联用NAC ( NN )组给予溴苯腈( 200 mg /kg )灌胃染毒后,即刻给予NAC ( 300 mg / kg)灌胃,N a-DM PS( 300 m g /kg) 腹腔注射。各组均于灌胃后 6 h断头处死,取大脑皮层组织检测。

采用反相高效液相色谱法测定脑组织腺苷酸ATP、ADP、AMP含量,并计算总腺苷酸( TAN) = ATP+ ADP + AMP; 细胞能荷( EC ) = ( ATP+ 1 /2ADP) /TAN。色谱条件: 日本岛津C₁₈ODS色谱分析柱( 5 Lm,200 mm × 4.6 mm ),流动相A :150 mm o l/L KH₂ PO₄ + 150 mmo l/L KCL,用4 m o l/L KOH 调pH 至6: 0; 流动相B:85% A相+ 15%乙腈。洗脱梯度: 0 m in,3% B; 5 m in,9% B; 9 m in,3% B; 平衡8 m in,柱温为16 ℃ ,检测波长254 nm,进样量20 LL,流速111 mL /m in。脑组织样品制备参照文献^〔2〕。

参照试剂盒说明书进行。分光光度法测定脑组织Na⁺ -K⁺ - ATPase和Ca²⁺ -M g²⁺ -ATPase活性,蛋白定量用B radford法。

应用SPSS 131 0统计软件进行分析,组间均数比较采用单因素方差分析。

表 1

表 1 各组小鼠脑组织腺苷酸含量〔x± s , n= 8, μmol/ ( g·湿脑组织) 〕

表 1 各组小鼠脑组织腺苷酸含量〔x± s , n= 8, μmol/ ( g·湿脑组织) 〕

与正常对照组比较,急性中毒组、Na-DM PS组、NAC 组小鼠脑组织ATP含量、EC 水平均明显降低(P < 0.05); NN 组EC 水平明显降低 (P < 0.05),ATP含量有降低趋势,但差异无统计学意义(P > 01 05); 各组AMP含量均较正常对照组升高(P < 0.05); 与急性中毒组比较,Na-DMPS组、NAC组及NN组小鼠脑组织ATP 含量、EC水平均明显升高(P < 0.05),AMP含量均明显下降 (P < 0.05)。

表 2

表 2 各组小鼠脑组织Na+ -K+ -ATPase和Ca2+-Mg2+ -ATPase活性[ (x± s , n= 8, U /( mg· pro t) ]

表 2 各组小鼠脑组织Na+ -K+ -ATPase和Ca2+-Mg2+ -ATPase活性[ (x± s , n= 8, U /( mg· pro t) ]

与正常对照组比较,急性中毒组、N a-DM PS组小鼠脑组织Na⁺-K⁺ -ATPase和Ca²⁺ -M g²⁺ -ATPase活性均明显降低 (P < 0.05 ); NAC 组、NN 组Na⁺ -K⁺ -ATPase 和Ca²⁺ -M g²⁺ - ATPase活性较正常对照组低,但差异无统计学意义。与急性中毒组比较,N a-DM PS 组、NAC 组及NN 组Na⁺-K⁺ -ATPase 和Ca²⁺-Mg²⁺ -ATPase活性均明显升高(P < 0.055)。

有文献报道^〔3〕,氰化钠中毒可导致线粒体内腺苷酸储备严重降低,进而影响离子泵功能。本实验结果显示,溴苯腈急性中毒6 h后,小鼠脑组织ATP含量、EC水平及Na⁺ -K⁺ -ATPase 、Ca²⁺ -M g²⁺ -ATPase活性明显下降,表明有机氰化物溴苯腈与氰化钠相似,亦可引起脑组织ATP生成减少,脑能量储备降低。而经药物Na-DM PS、NAC 单用及联用后,溴苯腈急性中毒小鼠脑组织能量储备均有不同程度增加,脑能量代谢障碍明显改善,神经细胞生物膜上的Na⁺-K⁺ -ATPase 和 C a2+ -M g²⁺ -ATPase活性明显提高,表明Na-DMPS、NAC 单用或联用对溴苯腈急性中毒小鼠脑组织均有较好保护作用,以 Na-DMPS联用NAC效果最明显。有研究表明,小鼠溴苯腈急性中毒经Na-DMPS保护后,肝组织黄嘌呤氧化酶( XOD )、过氧化氢酶( CAT)活力及过氧化氢( H₂O₂ )值均明显降低^〔4〕,提示Na-DMPS具有较强抗氧化作用,同时NAC 也是一种抗氧化剂^〔5〕,两者对溴苯腈急性中毒小鼠脑组织的保护作用,可能与其他氧化作用有关。