中国公共卫生  2010, Vol. 26 Issue (2): 231-232   PDF    
引用本文
邵圣文, 张志智, 顾红光. 铜绿假单胞菌生物膜形成及厚度实时检测[J]. 中国公共卫生, 2010, 26(2): 231-232.
SHAO Sheng-wen, ZHANG Zhi-zhi, GU Hong-guang. Real-time detection of development and thickness of Pseudomonas aeruginosa biofilm[J]. Chinese Journal of Public Health, 2010, 26(2): 231-232.
铜绿假单胞菌生物膜形成及厚度实时检测
邵圣文, 张志智, 顾红光    
湖州师范学院医学院创新实验室, 浙江湖州313000
数字出版日期: 2009-08-04.
基金项目: 浙江省自然科学基金(Y205011)
作者简介: 邵圣文(1974- ),男,江西都昌人,副教授,博士,研究方向:细菌致病性。
摘要: 目的 实时观察铜绿假单胞菌生物膜形成并测量其厚度。方法 将绿色荧光蛋白表达质粒转化铜绿假单胞菌,再采用激光共聚焦显微镜对活的生物膜进行水平逐层扫描,观察生物膜形成过程与形态,根据三维坐标系Z轴距离计算生物膜厚度。结果 铜绿假单胞菌生物膜形成过程分3个阶段:0~6 h为黏附阶段;6~24 h为聚集阶段,24~72 h为成熟阶段;6,24,48和72 h的生物膜厚度分别为(6.1±2.8),(29.2±2.3),(61.4±1.4),(61.8±1.1)μm。统计学分析表明,生物膜厚度6 h<24 h<48 h,差异有统计学意义(均P<0.01),48与72 h的生物膜厚度差异无统计学意义(P>0.05)。结论 激光共聚焦实时观察法能够用于铜绿假单胞菌生物膜形成检测以及生物膜厚度测量。
关键词: 生物膜     铜绿假单胞菌     激光共聚焦显微镜    
Real-time detection of development and thickness of Pseudomonas aeruginosa biofilm
SHAO Sheng-wen, ZHANG Zhi-zhi, GU Hong-guang    
Laboratory of Innovation, Medical School of Huzhou Norm College, Huzhou 313000, China
Abstract: Objective To conduct real-time observation of living biofilm formation and determine the thickness of the Pseudomonas aeruginosa biofilm.Methods After green fluorescent prote in(GFP)expression plasmid was transfected to Pseudomonas aeruginosa,the horizontal section scanning of living biofilm was done in real-time with confocal laser scanning micro scope(CLSM).The thickness of living biofilm was determined according to Zaxial distance.Results The biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa was observed in three stages,which were the adherence phase from 0 to 6 hours,the assembly phase from 6 to 24 hours,and the maturation phase from 24 to 72 hours.The thickness of the biofilm at 6,24,48, and 72 hr were 6.1±2.8,29.2±2.3,61.4±1.4,and 61.8±1.1μm,respectively.Statistical analysis showed that the thickness of the biofilm at 6 hr was less than that of at 24 hr(P < 0.01)and the thickness of the biofilm at 24 hr was less than that of at 48 hr(P < 0.01).There was no difference in the thickness of the biofilm between the time of 48 hr and 72 hr(P>0.05).Conclusion CLSM can be used to observe the biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa in real-time and to determine its thickness.
Key words: biofiml     Pseudomonas aeruginosa     confocal laser scanning microscope    

近年来,临床上细菌生物膜引起的顽固性感染日益增 多〔1〕。生物膜能增强细菌抵抗抗生素治疗和宿主免疫系统 攻击的能力,给临床治疗增加难度〔2〕。细菌生物膜的形成是 一个复杂的生物学过程,既往研究大多采用固定后染色法或 扫描电镜法观察生物膜形态,进而推断其形成过程。这些方 法观察到的均是固定后死亡状态的生物膜形态结构,未能观 察到生物膜活体形态结构〔3, 4〕。本研究采用电穿孔转化方 法〔5〕,将绿色荧光蛋白(GFP)原核表达质粒转化铜绿假单胞 菌,再采用激光共聚焦显微镜进行实时检测,旨在探讨生物膜 活体的形态特征及其形成过程,为寻找治疗细菌生物膜感染 的药物靶点提供科学依据。现报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料

(1)菌株:铜绿假单胞菌临床分离株12株(本实 验室保存),生物膜形成能力阳性162;绿色荧光蛋白原核表达 质粒pGEX4T- 1 - GFP(本室构建)。(2)试剂与仪器:大豆 胰酶肉汤(TSB )培养基(英国Ox oid公司);异丙基- B- D- 硫代半乳糖苷(IPTG;美国S igm a公司); M icroPulse r型电穿孔 仪(美国B io- Rad公司) ; LSM 510型激光共聚焦扫描显微镜 (德国Ze iss公司)

1.2 方法 1.2.1 pGEX4T- 1- GFP质粒转化细菌〔5〕

采用M icroPu lser 型电穿孔仪,电转条件为电容25 μF、电阻200Ω 、电压2 kV。将pGEX4T- 1- GFP质粒分别转化各株铜绿假单胞菌, 应用50 μg /mL氨苄青霉素筛选得到阳性转化子。

1.2.2 生物膜体外培养

向24孔细胞培养板小孔内加入 500 μL含100 μg /mL氨苄青霉素和0.2 mmol/L IPTG的TSB 培养基,将各株铜绿假单胞菌阳性转化子分别接种于每个小 孔内,再加入1片无菌盖玻片,37℃培养,每株细菌进行平行 双孔试验。分别在第6,24,48,72 h各取出1片盖玻片,生理 盐水洗涤3次后激光共聚焦显微镜观察。

1.2.3 生物膜激光共聚焦显微镜观察及厚度测量

(1)生 物膜观察:采用LSM 510型激光共聚焦扫描显微镜,37 ℃恒 温载物台,物镜倒置。扫描模式: Kr /A r激光,Ex /Em为488 / 515 nm,水平逐层扫描,步距为14 μm,扫描10层。(2 )生物 膜厚度确定:对生物膜标本由内(生物膜与玻片相贴面)向外 (生物膜游离面)沿三维坐标系Z轴逐层水平扫描,步距14 μm,当出现2个连续的水平层面,Z轴距离较小的水平层面 上能够观察到生物膜结构,Z轴距离较大的水平层面上不能 够观察到生物膜结构,则后一水平层面的Z轴距离为生物膜 厚度(€x±s )。

1.3 统计分析

生物膜厚度以€x±s表示,采用SPSS 11.0软 件进行分析;均数比较采用t检验。

2 结果 2.1 生物膜形成过程中的形态变化(图 1)
注: 箭头所示为生物膜水通道 图 1 铜绿假单胞菌生物膜形成过程中的形态变化( 40×油镜和20×物镜, 分辨率512×512)

图 1显示,6 h 生物膜尚处于早期黏附阶段,细菌散在分布; 24 h生物膜处于 聚集阶段,局部细菌团块形成; 48 h生物膜基本成熟,大片致密膜样结构形成,多条生物膜水通道间隔分布其中; 72 h生物 膜完全成熟,致密膜样结构融合,偶有生物膜水通道间隔分布 其中。

2.2 生物膜厚度的测量(图 2)
图 2 铜绿假单胞菌成熟期生物膜厚度( 48 h)

图 2显示,Z轴距离为 35.320 Lm时,激光共聚焦显微镜能观察到生物膜结构; Z轴 距离为49.448 Lm时,仍能观察到生物膜结构; Z轴距离为 63.576 μm时,不能观察到生物膜结构,表明菌株48 h生物膜 厚度为63.576 μm。

2.3 不同生长阶段的生物膜厚度

12株铜绿假单胞菌在6, 24,48和72h的生物膜平均厚度分别为(6.1±2.8),(29.2 ± 2.3),(61.4 ± 1.4),(61.8 ± 1.1) μm。统计学分析表明,生物 膜平均厚度6 h < 24 h < 48 h,差异均有统计学意义(均P < 0.01); 48 h生物膜平均厚度与72 h生物膜相近,差异无统计 学意义( < > 0.05)。

3 讨论

生物膜是具有三维空间结构的生物体,由细菌以及细菌 产生的基质组成,其中的基质包括多糖、蛋白质、DNA分子及 其他多种大分子物质〔7〕。生物膜内的细菌代谢缓慢,细菌与 细菌之间形成微菌落样集合体,微菌落周围被细菌产生的基 质包裹,以上特性使得生物膜细菌表型与普通浮游态细菌有 很大不同〔8〕,一方面使得抗生素难于有效进入到微菌落内 部,另一方面阻止了宿主免疫细胞对微菌落内部细菌的识别, 从而导致生物膜细菌引发的感染持续时间长、容易慢性化以 及多次反复发作〔2, 8〕。

研究表明,生物膜发育过程大致可分为黏附,聚集,成熟 以及部分解体共4个阶段〔6, 8〕。本研究观察到生物膜发育过 程中的黏附、聚集、成熟3个阶段,没有观察到部分解体阶段, 这是由于研究观察的是0~ 72 h内生物膜的发育过程,而生 物膜部分解体阶段是发生在72 h之后。

观察生物膜形态结构的常用方法是扫描电镜法〔9〕,要求 对生物膜进行固定后再进行观察,观察的是处于死亡状态的 生物膜形态结构,并且不能测量生物膜厚度。应用GFP标记 后激光共聚焦显微镜观察法,一方面可实时观察活体状态下 的生物膜形成过程,另一方面还能用于测量生物膜厚度。该 方法具有不破坏生物膜结构,能够实时观察活体状态的生物 膜形成过程以及内部结构变化等优点,在研究生物膜形态结 构时具有应用价值。

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