中国公共卫生  2010, Vol. 26 Issue (2): 214-215   PDF    
引用本文
叶菊风, 罗炳德. 高温及内毒素复合因素对IL-1βmRNA表达影响[J]. 中国公共卫生, 2010, 26(2): 214-215.
YE Ju-feng, LUO Bing-de. Effects of high temperature and lipopolysaceharide(LPS) on IL-1 β mRNA expression in RAW 264.7 cells[J]. Chinese Journal of Public Health, 2010, 26(2): 214-215.
高温及内毒素复合因素对IL-1βmRNA表达影响
叶菊风, 罗炳德    
南方医科大学公共卫生与热带医学学院儿少卫生学系, 广东广州510515
数字出版日期: 2009-03-23.
基金项目: 广东省自然科学基金(5004774)
作者简介: 叶菊风(1978- ),女,福建邵武人,助理实验师,硕士,研究方向:中暑的发病机制。
通讯联系人: 罗炳德
摘要: 目的 探讨高温和内毒素(LPS)复合因素对RAW 264.7细胞IL-1βmRNA表达的影响。方法 采用体外培养的巨噬细胞系RAW 264.7细胞,分为37,40℃对照组,37,40℃LPS组。用RT-PCR方法检测RAW 264.7细胞IL-1βmRNA表达。结果 RAW 264.7细胞在37和40℃加或不加LPS条件下随着时间的变化IL-1βmRNA表达各不相同,在37℃条件下,LPS组随着时间的不断延长,IL-1βmRNA表达不断增强;40℃条件下对照组IL-1βmRNA表达亦表现出不断增强,而LPS组IL-1βmRNA表达表现为先增强后减弱。结论 高温和内毒素复合因素能够下调RAW 264.7细胞IL-1βmRNA表达,考虑其原因与高温和内毒素复合因素诱导产生的热休克蛋白及该条件下RAW264.7细胞的大量凋亡有关。
关键词: 高温     内毒素     白细胞介素-1(IL-1βmRNA)    
Effects of high temperature and lipopolysaceharide(LPS) on IL-1 β mRNA expression in RAW 264.7 cells
YE Ju-feng, LUO Bing-de    
Department of Child and Adolescent Health, School of Public Health and Tropical Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
Abstract: Objective To study the effects of high temperature and LPS on IL-1 βmRNA expression in RAW 264.7 cells.Methods Macrophage cell line RAW 264.7 in vitro was divided into 4 groups(control group of 37℃,LPSg roup of 37℃,control group of 40℃,LPS group of 40℃).The expression of IL-1β mRNA was detected with RT-PCR.Results The IL-1β mRNA expression of RAW 264.7 cells was differen tunder the condition of 37℃ and 4℃ with or without LPS.The IL-1β mRNA expression of LPS group increased at 37℃;the blank group of 40℃ tended to ascend gradually while the LPS group of 40℃ ascended firstly but descended finally.Conclusion Temperature could affect the IL-1β mRNA expression in RAW 264.7 cells.High temperature and LPS co uld down-regulate IL-1β mRNA expression.
Key words: high temperature     lipopoly sacehamide     IL-1    

白细胞介素-1( interleuk in-1,IL-1)是主要的内源性致热 源。鉴于IL-1在中暑的发病过程中的作用以及与内毒素血 症的关系,本研究探讨了在常温( 37℃)和高温( 40℃)及同 时有内毒素( LPS )存在时对巨噬细胞系RAW 26417细胞 IL-1B mRNA表达的影响,为防治高温对机体的损伤提供新 的理论依据。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

细菌内毒素( LPS,美国sigma公司); RPMI-1640基础培养液( Cat No. 31800 - 022,Lot No. 1120708)、磷酸盐缓冲液( PBS) 、胰酶(美国Gibco公司);小 牛血清(杭州四季青公司),灭活后分装,于- 20℃保存; Trizo l试剂(上海Invitrogen分公司);二氧化碳培养箱(美国 NAPCO公司,MODEL 5410);琼脂糖凝胶电泳仪(美国Bio-Rad公司,MODEL 200/2.0); Doc Gel 2000凝胶扫描成像系统 (美国B io-Rad公司) 。

1.2 细胞

RAW 264.7细胞株,小鼠来源的巨噬细胞系,用 RPM I-1640完全培养基(含10%灭活小牛血清、100μ/mL青 霉素和100μg/mL链霉素,pH 7.1~ 7.2)传代培养。

1.3 实验方法 1.3.1 IL-1 BmRNA在同一复合因素下不同时间的表达

实验分为4个组,依次为37,40℃空白组,37,40℃LPS组。向 培养有细胞的96孔板中(共计4块96孔板,每板中设立5个 复孔,每孔中加入细胞悬液200 μL) ,向2,4号培养板分别加 LPS 1 μL(使LPS终浓度为0。1 μg /mL)。将1,2号培养板放 入37℃含95% O2、5% CO2的细胞培养箱中,将3,4号培养板 放入40℃含95% O2、5% CO2的细胞培养箱中,于1,2,3 h 后取出,倒掉培养液,4℃预冷的PBS洗2次,加入Tr izo l 2 mL 试剂,充分裂解细胞后分装于115 mL EP管中- 70℃冰箱保 存待测。

1.3.2 IL-1 BmRNA在不同温度和内毒素复合因素下的表达

实验分为4个组,依次为37,38,39,40℃LPS组。向培养 有细胞的96孔板中(共计4块96孔板,每板中设立5个复 孔,每孔中加入细胞悬液200 μL ),向4块培养板中均加入 LPS 1μL(使LPS终浓度为011 μg /mL)。将1~ 4号培养板 依次放入37,38,39和40℃含95% O2、5% CO2的细胞培养 箱中,于3 h后取出,其余实验操作步骤同上。

1.3.3 IL-1 BmRNA表达的测定

采用Tr izo l提取细胞总 RNA,逆转录( RT) -PCR方法检测IL-1B mRNA表达,管家基 因hptr ( hypoxanthine-guan ine phosphor ibosyltr- ansferase,次黄 嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖核酸转移酶)作为内源性对照物,以目 的基因扩增量/内对照基因扩增量表示所要检测基因的表达 量,每组实验重复3次。

1.4 统计分析

采用SPSS 11.5软件进行方差分析。

2 结果 2.1 同一复合因素下不同时间IL-1 BmRNA的表达(图 1,表 1)
图 1 温度内毒素复合因素对RAW 2641 7细胞IL-1 BmRNA表达的影响

表 1 温度及内毒素复合因素对IL-1 B mRNA表达的影响(x±s)

RAW 264.7细胞在37和40℃加或不加LPS条件下随 着时间的变化IL-1 B mRNA表达各不相同。温度与内毒素对 RAW 264.7细胞IL-1 B mRNA表达有影响,温度升高能引起 IL-1 BmRNA表达上调,内毒素在37℃条件下也能够上调L-1 BmRNA的表达,但高温内毒素复合因素将下调IL-1 BmRNA 表达。在37℃条件下,LPS组随着时间的不断延长,IL-1 BmRNA表达不断增强,至2 h时与空白对照组比较差异有统 计学意义(P < 01 05); 3 h时差异更明显(P < 01 01); 40℃条 件下不加LPS组IL-1B mRNA表达亦表现出不断增强趋势, 其中3,2与1 h比较差异均有统计学意义(P < 0105); 40℃ 条件下LPS组IL-1 B mRNA表达表现为先增强后下降的趋 势,其中LPS组处理3 h后IL-1 B mRNA表达较LPS组处理2 h减弱,2组比较差异有统计学意义(P < 01 05)。

2.2 不同温度和内毒素复合因素下IL-1 BmRNA表达(图 2)
图 2 不同温度内毒素复合因素对RAW 2641 7细胞IL-1 BmRNA 表达的影响

IL-1 BmRNA表达随着温度的不断升高呈现出先上调后下调 的趋势,其中以38 ℃时表达最高,40℃表达最低;进一步分 析发现,40℃条件下的表达量与37和38 e比较,差异有统 计学意义(P < 01 05)。说明温度对LPS刺激RAW 2641 7细胞 的IL-1 BmRNA表达作用在38 e时最强,更高的温度则会下 调IL-1BmRNA的表达。

3 讨论

研究表明,高温、内毒素通过调节热休克蛋白70(HSP 70)的 合成进而影响IL-1 BmRNA表达。生物细胞在受热和其他损 伤、应激因素作用后,合成H SPs〔1〕。H SPs)能够抑制LPS诱 导IL-1、肿瘤坏死因子-A( TNF-A)等促炎症细胞因子的表 达〔2, 3, 4〕。张魏巍等〔5〕研究发现,正常细胞组HSP 70呈低水平 表达,给予高温内毒素复合因素刺激后,H SP 70 mRNA和蛋 白表达水平均有所增高。HR Wong等〔6〕研究发现,热应激反 应生成的HSP 70能够减弱内毒素诱导的细胞凋亡,提高温度 能够诱导H SPs的产生而下调IL-1 B RNA的生物合成。 Schm idt JA等〔7〕研究表明,用体外培养的人单核细胞系THP- 1细胞实验,在高温( 39~ 41℃)和内毒素复合条件下,作业2 ~ 4 h后,H SP 70和H SP 90表达量增加,IL-1前体蛋白P 35 表达减少。

根据上述研究,推测本实验结果,40℃条件下空白组IL- 1 B mRNA表达出增强的趋势,其中3、2与1 h比较差异均有 统计学意义( P < 0105),但3与2 h之间差异无统计学意义, 表现出表达稳定的趋势,原因可能是单纯的高温因素对IL-1B mRNA表达的影响弱于高温和内毒素复合因素的影响,需要 更长的作用时间才能降低IL-1 B mRNA表达。同时也观察到 40℃条件下LPS组IL-1BmRNA表达出现了先上调后下调的 变化趋势,至2 h时表达开始下降,原因可能是作用开始时, H SPs的表达量较少,不足以抑制P 35的表达,随着作用时间 的延长,H SPs的表达大幅增加,足以抑制P 35表达,最后IL-1 B mRNA表达减少。实验表明,高温内毒素复合因素刺激比 单纯热应激更能抑制IL-1 BmRNA表达。但H SPs与IL-1 B mRNA在高温和内毒素复合因素下的量变关系尚不明确,有 待于进一步研究。

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