猪链球菌2型(Streptococcussuistype2,SS2)是一种重要的人兽共患病病原体,可引起猪的脑膜炎、关节炎和人的急性脑膜炎等,对集约化养猪业和相关从业人员造成伤害^{〔1, 2〕}。猪链球菌荚膜血清型已达35种,多种血清型均有致病性,普遍认为猪链球菌2型(SS2)致病力最强^〔3〕。猪链球菌的毒力因子主要有荚膜多糖(CPS)、溶菌酶释放蛋白(MRP)、胞外因子(EF)、谷氨酸脱氢酶(GDH)等。其中谷氨酸脱氢酶在进化上属于极为保守的蛋白,其编码基因在SS2中保守存在13-52,可以作为检测猪链球菌的重要诊断性抗原^〔6〕。为探讨GDH在猪链球菌致病机制中的作用,并且建立相应新型检测方法,本研究扩增猪链球菌2型国内患者分离株和病猪分离株的GDH基因,对其进行T-A克隆、测序及序列分析,为进一步研究gdh提供基础依据。

(1)菌株及质粒:猪链球菌2型患者分离株(2007SF0165,分离自广州花都区人民医院患者,本室保存);病猪分离株(HA9801,华南农业大学惠赠);受体菌E.coliJM109、质粒pMD19-TVector(大连宝生物工程有限公司)。(2)试剂:PCR扩增试剂盒、T4DNA连接酶、DNA100bpmarker、PCR产物回收纯化试剂盒、X-gal、异丙基-B-D硫代乳糖苷IPTG、Amp(大连宝生物工程有限公司)。

参照文献^〔7〕设计合成引物,进行PCR扩增。上游引物(P1):5'-GTGGATCCATGTCAAATGCCAAAG-3';下游引物(P2):5'-GTTAGAGTCGACTTATACCAAACCTTGG-3';上游引物中引入BamHI酶切位点,下游引物中引入SalI酶切位点;预计扩增长度约为1300bp。PCR扩增条件为94℃60s;53℃60s;72℃90s,共30个循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,割胶称重经PCR产物回收纯化试剂盒回收,按说明书操作。

在微量离心管中配制pMD19-TVector1LL,InsertDNA0.1~0.3pmo,ldH2O补充至5LL,然后加入5LL溶液I,16℃反应30min;接着全量加入至100μL JM109感受态细胞中,冰中放置30min,42℃加热45s后,再在冰中放置1min。随后加入890μLSOC培养基,37℃振荡培养60min。最后,在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养,形成单菌落,计数白色、蓝色菌落。挑选阳性重组菌即白色菌落,使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小,委托上海生工生物工程技术有限公司测序。

gdh基测序结果在NCBI上进行BLAST分析,同时用软件DNAStar对测序结果和参考序列进行同源性分析和相应的谷氨酸脱氢酶GDH氨基酸序列进行预测分析。

图 1

注: 1: 患者分离株2007 SF 0165; 2: 病猪 分离株HA 9801; M: m arker 100 bp。 图 1 gdh PCR 扩增产物

2株猪链球菌2型菌株的PCR 扩增产物经电泳后,均得到1 300 bp左右的目的条带,大小与 预测一致。

图 2

注: 1: 空质粒pMD 19-T; 2: 患者分离株2007 SF 0165; 3: 病猪分离株HA9801; M: 100bpm arker。 图 2 克隆产物gdh PCR扩增鉴定

重组质粒转化JM109感受态细胞,经X-Gal、IPTG、Amp筛选得到阳性重组菌,挑选阳性重组菌,提取重组质粒作为模板,使用目的基因引物用PCR扩增法确认载体中插入片段的长度大小。含有目的基因的重组质粒均能扩增出1300bp左右的目的条带,而不含目的基因的空质粒不能扩增出目的条带,说明GDH基因片段已成功克隆。

将测序结果两端的载体序列和部分引物序列去除后,得到1347bp的gdh基因全部序列,用软件分析预测可编码448个氨基酸。人源猪链球菌2型gdh基因序列GC含量为45.73%,猪源猪链球菌2型gdh基因序列GC含量为45.88%,猪链球菌2型gdh参考序列GC含量为45.81%。序列分析果显示,人源与猪源猪链球菌2型gdh序列同参考序列比较,人源猪链球菌2型在828处为T而参考序列为C,猪源猪链球菌2型在662处为C而参考序列为T。同参考序列比较,一致性均为99.9%。人源与猪源猪链球菌2型GDH序列仅相差2个碱基,具有GDH蛋白家族I的典型保守序列。

本研究通过TA克隆得到猪链球菌2型GDH基因,测序结果显示,不管是人源分离株,还是猪源分离株,与猪链球菌2型GDH参考序列相比,只有1个碱基不同,序列高度保守,并且GC含量均在45%左右。通过软件预测分析,发现它们编码的氨基酸序列具有GDH蛋白家族I的典型保守序列,应属于GDH蛋白家族Ⅰ。

谷氨酸脱氢酶在进化上是极为保守的一种蛋白质,是一 种重要的诊断性抗原,由于猪链球菌类型多样,毒力因子复杂 不一,且各毒力因子的致病机理和相互作用与关系仍未明确,对该病的诊断和防治仍缺乏有效手段。本文的研究结果为进 一步表达GDH 蛋白、研究GDH 蛋白功效、空间结构等提供理 论基础,为研究GDH 在猪链球菌致病机制中的作用,以及建 立猪链球菌检测方法等方面提供重要的参考价值^〔8〕。