军团菌是引起军团菌病的病原菌,在水中分布广泛,基因存在多样性,从同一地点可以分出多种军团菌,常规分型技术很难将其分型,对溯源造成困难。目前很多分子分型方法应用于军团菌分型研究,但大部分方法没有标准化,因此,需要对不同的分型方法进行比较^{〔1, 2〕}。(PFGE)是在传统DNA琼脂糖凝胶电泳基础上进一步发展的方法,该方法对基因全序列进行分析,通过电场方向的不断改变,保证大片段DNA的分析,具有高效分型能力,且重复性好,特异性高,结果容易判断等优点^〔3〕。扩增军团菌巨噬细胞感染力增强因子基因(MacrophageInfectivityPotentiator,MIP)分型方法是近10年来的一种基因分型新方法^〔4〕,MIP基因编码军团菌特有的外膜蛋白,该基因具有相对稳定性(如同管家基因)^〔5〕,可以作为分型的主要指标。本研究采用PFGE与MIP2种方法对嗜肺军团菌进行分型。现将结果报告如下。

(1)菌株:48株嗜肺军团菌均分离自深圳市公共场所中央空调冷却塔水,并经乳胶凝集试验鉴定为嗜肺军团菌。(2)主要试剂:MIP分型引物及测序序列见文献^〔4〕(上海生物工程有限公司合成);军团菌培养基BCYE,加入抑菌剂的军团菌培养基GVPC,乳胶凝集试剂Lp1型与Lp2-14型(英国Oxoid公司);PCR系列试剂盒(大连宝生物工程有限公司);SeaKemGoldAgarose(美国Cambrex公司);SfiÑ,XbaÑ限制性内切酶,蛋白酶K(日本TaKaRa公司)。(3)主要仪器设备:CO₂培养箱(美国Shellab公司);基因扩增仪(英国Barloworl公司);水浴摇床(英国Grant公司);脉冲场凝胶电泳仪及电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

( 1) DNA 模板准备: 刮取BCYE 培养基上一定菌 量,研磨入1 mL灭菌蒸馏水,混匀,8 000 g /m in 离心5 m in,吸弃上清,沉淀用双蒸水反复洗涤2~ 3次,8 000 g /m in 离心 5 m in,弃上清加入50 μL双蒸水,100 ℃ 煮沸15 m in,-20 ℃ 冷冻5 m in,13 000 g /m in 离心5 m in,取上清即为模板,用于 PCR扩增。( 2) PCR 扩增体系和反应条件总体积50 LL,包 括1. 5 mm ol/LM g²⁺ ,10 mmo l/L Tr is-HC l( pH 8. 3) ,50 mm o l/L KC ,l 200 Lmo l/L dNTP; 上下游引物各20 pmoL,Taq 酶( 2. 5 U) ,DNA模板10 ~ 100 ng。反应条件: 96 e ,3 m in; 94 e ,1 m in,58 ℃ ,2 m in,72 ℃ ,2 m in,35个循环; 72 ℃ ,5 m in。( 3) 扩增产物测序: 由上海生物工程有限公司完成。( 4) 菌株经 PCR扩增测序: 序列上传与EWGLI 数据库比对,得出相应 M IP型别。( 5) PFGE 方法: 按文献^〔6〕。( 6)分析方法: 采用 B ioNum erics软件对全染色体DNA 酶切图谱进行聚类分析。

共分为5 种型别,分别为 L. pnuem ophile-phil-1、L. pnuem ophile-phil-sg 3、L. pnuem ophilep hil-D-15、L. pnuem ophile-phil-sg 10 与L. p nuemop hile-phil-97-2 898。其中L. pnuem ophile-phil-1型共29 株,L. pnuem oph ileph il-sg 3型8株,L. pnuem ophile-phil-sg 10型9 株,L. pnuem ophile-phil-D-15与L. p nuemop hile-phil-97-2898型各1株。

图 1

注: M: 为Salm onella( H 9812)参考标准株DNA经XbaI酶切 之后电泳图谱, 分子量最大为1135 kb, 最小为33. 3 kb; 1 ~ 3, 5 ~ 8: 嗜肺军团菌菌株经SfiⅠ 酶切后电泳图谱。 图 1 部分嗜肺军团菌菌株PFGE分型图谱

经脉冲场电泳,DNA 片段得到良好分离,各株细菌DNA 条带数目为12~ 15之间,分子量在33. 3 ~ 1135 kb之间。48株嗜肺军团菌经PFGE分型,各型别间存在差异,没有优势型别。

图 2

注: M IP型别表示该菌株通过M IP分型所得到1~ 5 型; 1: L. pnuemophile-phil-1; 2: L. pnuemophile-phil-sg 3; 3: L. pnuemophile-phil-D-15; 4: L. pnuemophile-phil-sg 10; 5: L. pnuemophile-phil-97- 2898; PFGE 型别表示该图 谱经聚类分析所得23种类型, 从上之下分别为1~ 23型。 图 2 PFGE树状图结果

48株嗜肺军团菌,经M IP分型方法分为5型,PFGE分型方法分为23型。M IP 1 型包括3,4,5,10,13,15,16,17,18,19,21,22,23PFGE 型; M IP 2型包括8、9 PFGE 型; M IP 3、M IP 5型分别为12,14 PFGE 型; M IP4型包括1,2,6,7,11,20 PFGE 型。除M IP 3、M IP 5 型分型结果与PFGE分型结果一致外,PFGE 分型方法将M IP 1型又分为13种,M IP 2型分为2种,M IP 4型分为6种。

MIP分型方法将48株嗜肺军团菌分为5种型别,其中L. pnuem ophile-phil-1型别为M IP分型中的主要型别,占60. 4%。 PFGE方法又将M IP1型分为13种型,利用PFGE方法未发现 优势菌群。

嗜肺军团菌分别分离自深圳市5个区,利用2种方法分型,各区分离菌株均存在多态性,但PFGE方法比MIP方法分型型别更多。分离自同一冷却塔水的4株菌,血清型分别为Lp1型与Lp2-14型,MIP分型结果均为MIP1型,PFGE分型结果将同为Lp1型菌株又分为2种型别,2菌之间的相似度为76.73%。本研究中共有Lp1型菌株25株,MIP分型结果为1型与2型,PFGE分型结果为12种型别。

MIP分型方法是基于军团菌其中一个基因的序列分析,而PFGE分型方法是对全基因序列分析。MIP分型中属于同一型别,但采用PFGE分型则又分为多个型别,且菌株间亲缘关系较远。PFGE方法是在MIP分型基础上进一步分型,因此,PFGE方法更有利于流行病学调查溯源分型。