中国公共卫生  2010, Vol. 26 Issue (2): 198-200   PDF    
引用本文
黄芳, 吴小南, 陈洁, 汪家梨. 亚油酸/二十二碳六稀酸对胃癌细胞凋亡作用[J]. 中国公共卫生, 2010, 26(2): 198-200.
HUANG Fang, WU Xiao-nan, CHEN Jie ,et al. Effect leinoleic acid/docosahexaenoic acid on apoptosis of human gastric cancer cells[J]. Chinese Journal of Public Health, 2010, 26(2): 198-200.
亚油酸/二十二碳六稀酸对胃癌细胞凋亡作用
黄芳, 吴小南, 陈洁, 汪家梨    
福建医科大学公共卫生学院营养与保健医学系, 福州350004
收稿日期: 2009-08-28.
基金项目: 福建省科技厅科技平台建设基金(2008L0001);福建省教育厅资助省属高校项目(2007F5047);福建医科大学环境与健康重点学科发展基金项目(GW15)
作者简介: 黄芳(1973- ),女,福建福州人,讲师,博士,研究方向:营养与慢性病。
摘要: 目的 探讨不同比例亚油酸(LA)/二十二碳六稀酸(DHA)对人胃癌细胞株MKN-45的抑制作用。方法 采用均匀设计法初筛出LA/DHA抑制MKN-45增殖的较佳比例,采用随机区组法确定促进胃癌细胞凋亡的最佳比例;采用LA/DHA最佳比例混合脂肪酸干预MKN-45裸小鼠移植模型6周,观察裸鼠肿瘤重量、肿瘤体积变化及毒副反应情况;肿瘤组织HE染色观察肿瘤细胞形态学改变。结果 经均匀设计和随机区组筛选,LA/DHA比例为1:3时,浓度为40:120μmol/L时,对肿瘤细胞的抑制效果最佳(P<0.05);与对照组比较,1:3 LA/DHA混合脂肪酸高剂量组瘤体抑制率为21.97%,瘤重的抑制率为18.09%,差异有统计学意义(P<0.05);肿瘤组织病理切片显示,高剂量组和抗癌药物阳性对照组的肿瘤组织中出现不同程度坏死;高剂量组毒副反应不明显。结论 LA/DHA比例为1:3可诱导人胃癌MKN-45细胞凋亡;LA/DHA高剂量组有一定抑瘤作用,并且无明显毒副反应。
关键词: 亚油酸(LA)     二十二碳六稀酸(DHA)     胃癌细胞MKN-45     凋亡     裸鼠    
Effect leinoleic acid/docosahexaenoic acid on apoptosis of human gastric cancer cells
HUANG Fang, WU Xiao-nan, CHEN Jie , et al    
School of Public Health, Fujian Medical University, Fuzhou 350004, China
Abstract: Objective To explore the effects of different constituent ratio leinoleic acid(LA)/docosahexaenoic acid (DHA)on apoptosis of human gastric cancer cell line MKN-45.Methods With uniform design,the better constituen tratio for the inhibition of MKN-45 cell was scrceend.Then the best ratio was determined with randomized block design.The tumor volume,side-effect, and tumor weigh of tumor-bearing nude mice after treatment were observed.The morpho logical changes of tumor tissue were assessed by HE staining.Results The LA/DHA constituen tratio of 1:3 showed maximum inhibition of the tumor cells.Six weeks after high concentration treatment, the mean tumor volume decreased by 21.97% and the mean tumor weigh by 18.09% with statistical significance compared with that of control group(P<0.05).The toxicit of the treatment was not obvious.Microscopic examination showed that there were massive areas of cytoclasis and apoptosis in the tumor tissue of the high concentration group and 5-FU group.Conclusion The 1:3 constituen tratio of LA/DHA could induce the apoptosis of human gastric cancer cell line MKN-45.The high concentration of 1:3 constituent ratio treatment could also inhibit tumor in vivo without significant side-effect.
Key words: leinoleic acid(LA)     docosahexaenoic acid(DHA)     human gastric cell line MKN-45     apoptosis     nude mouse    

胃癌是引起癌症死亡的第二大主因〔1〕,因此,研究有效、安全的治疗方法和抗癌药物具有重要意义。多不饱和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacid,PUFA)是指含有2个或2个以上不饱和双键结构的脂肪酸,根据其首个不饱和键的位置可分为n-6、n-3两大类。研究证实,不同比例n-6/n-3PUFA膳食对于激素相关性肿瘤如乳腺癌具有不同作用〔2, 3〕。为了探讨不同比例多不饱和脂肪酸对胃癌细胞的抑制作用,本研究应用均匀设计和随机区组设计相结合的方法〔4〕,观察了n-6系列的亚油酸(LA)/n-3系列的二十二碳六烯酸(DHA)抑制肿瘤细胞的最佳比例和最佳浓度,及其对裸鼠原位移植人胃癌MKN-45细胞系生长的影响。结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞与动物

胃癌细胞MKN-45(北京市肿瘤研究所);BALB/cnu/nu裸鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司,许可证号SCXK(沪)2007-0005):20只,4~5周龄,雌雄各半,体重(18±3)g。饲养于无菌动物试验室。经高压灭菌的标准饲料和水供动物自由饮食。由福建医科大学实验动物中心提供无特定病原体(SPF)级饲养。

1.1.2 主要试剂与仪器

亚油酸(LA)、二十二碳六烯酸(DHA)、二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司);LA和DHA用无水乙醇溶解,4e保存,实验前以1640培养液稀释成不同浓度,酒精终浓度不超过012%。RPMI-1640、胎牛血清、胰酶(美国Gibco公司);四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)(华美生物工程公司);5-氟尿嘧啶(5-FU)(国药集团化学试剂有限公司),批号:F20060412。

1.2 方法 1.2.1 不同配比LA /DHA对人胃癌MKN-45 细胞抑制作用

人胃癌MKN-45细胞置5%CO2、37℃培养,将5×103个细胞加入96孔板中培养24h。采用均匀设计法,将2种多不饱和脂肪酸浓度分别为0,10,20,40,80μmol/L,设计10种配比给药方案,依次加入到培养板,分别培养48h,再用含015mg/mLMTT的无血清培养基继续培养4h,弃上清,每孔加DMSO150μL,微量振荡器摇振5min,酶标仪波长570nm处测定吸光度(A)值,每种配方平行做6次,取平均值,建立回归方程,评估2种多不饱和脂肪酸对肿瘤细胞的作用并筛选较佳比例;同时采用随机区组设计,以LA浓度为0,10,20,40,80Lmol/L,DHA以1B2,1B3,1B4,1B5,1B6分别进行配比给药方案,按上述培养和检测程序,获得各配比方案吸光度(A)值,经统计分析获得确切的最佳配比和最佳浓度。

1.2.2 LA /DHA 最佳配比对裸鼠移植瘤抑制作用

收集对数生长期的5×107/mLMKN-45细胞液,在无菌实验条件下,裸小鼠右侧腋窝皮下注射细胞液012mL;20d后,取右腋下出现直径5mm结节裸鼠17只(移植成功率85%),随机分为5组,其中阴性对照组2只,每3d腹腔注射0.2mL无菌生理盐水,共14次;阳性对照组3只,腹腔注射5-FU(60mg/kg),每6d注射1次,共7次;高、中、低剂量组各4只。将LA/DHA按最佳配比混合后,分别腹腔注射120,80,40mg/kg,每3d注射1次,共14次。42d后,颈部脱臼法处死全部荷瘤鼠,剥离瘤体。肿瘤体积(V)按公式:V=1/2ab2(a=瘤长,b=瘤宽)计算;称取瘤重(w),计算抑瘤率。抑瘤率=(对照组-实验组)/对照组×100%。按苏木素-伊红(HE)染色法将肿瘤组织块经脱水、浸蜡、包埋、脱蜡、染色和封片等处理后,显微镜下观察。

1.3 统计分析

采用SPSS 1310软件进行统计分析,多组资料比较采用单因素方差分析(ANOVA)及最小显著差( LSD)法。

2 结 果 2.1 不同配比LA /DHA 对人胃癌MKN-45细胞抑制作用

经均匀设计法建立的回归方程: y = 01 714 + 0102 LA-01 05 DHA,R2 = 01 888(F = 271 624,P < 0.01) ,表明所建回归方程 可信。评估结果显示,DHA对人胃癌MKN-45细胞具有较好 的抑制增殖作用,而LA 对人胃癌MKN-45细胞具有促进增殖 作用,LA /DHA 比例在20: 80 ( 1: 4) μmo l/L 时,A 值最低 ( 01 346),表明这一配比对胃癌细胞抑制效果较佳。与对照 组比较,随机区组法的LA /DHA 各种浓度和配比,均有抑制 胃癌MKN-45细胞的作用(均P < 0.05); 当LA /DHA 比例为 1: 3时,半数致死量较低( 6.15),表明LA /DHA 比例达到1: 3,浓度为40: 120 μmo l/L 时,对肿瘤细胞的抑制效果最佳 ( P < 0.05) 。

2.2 LA /DHA 最佳配比对裸鼠移植瘤抑制作用( 表 1)
表 1 1: 3 LA /DHA 混合脂肪酸对裸鼠移植瘤的影响(…x ± s)

选 择LA /DHA 最佳配比( 1: 3) 混合脂肪酸,观察对裸鼠移植瘤 的抑制作用。表 1可见,与对照组比较,高剂量脂肪酸混合组 的肿瘤体积和重量减小,差异有统计学意义,但高剂量脂肪酸 混合组抑制肿瘤的作用不如5-FU (P < 0105)。

2.3 肿瘤组织形态学变化( 图 1)
图 1 LA /DHA 最佳配比对裸鼠移植瘤组织形态学的影响( 400 × )

图 1可见,阴性对照组、LA/DHA低剂量组的肿瘤细胞异型性明显,生长旺盛,肿瘤组织没有或只有少量坏死和凋亡表现;LA/DHA中剂量组、高剂量组和阳性对照组中可见成片的肿瘤细胞坏死,部分肿瘤细胞表现为胞核致密固缩,胞浆红染。

2.4 毒副作用

观察结果显示,LA/DHA各剂量组裸鼠均无死亡,各组体重变化差异无统计学意义,裸鼠一般情况(皮毛、活动、体重和进食)无明显变化,肺、肝、脾、肾、心等脏器经肉眼观察和病理切片,未见特殊异常。

3 讨 论

研究发现,n-6PUFAs与n-3PUFAs对肿瘤的影响不同,富含n-6PUFAs(亚油酸等)的膳食可增加多种肿瘤发生率并促进动物模型体内移植瘤生长;而摄入富含n-3PUFAs(二十二碳六烯酸)的膳食可抑制肿瘤发生及动物模型移植瘤生长〔5, 6, 7〕。本研究结果显示,DHA确有促进胃癌细胞凋亡的作用,LA则对胃癌细胞增殖有促进作用。并且在体外细胞培养条件下,LA/DHA比例为1:3时对肿瘤细胞的抑制效果最佳,其高剂量组(120mg/kg)有一定抑瘤作用,并且没有明显的毒副反应。

参考文献
〔1〕 Hohenb erger P,Gretschel S.Gast ric cancer[J].Lan cet,2003,362 (9380):305-315.
〔2〕 王静,糜漫天,韦娜,等.n-6/n-3 PUFA对乳腺癌大鼠ER及p 53表达影响[J].中国公共卫生,2009,25(1):48-50.
〔3〕 韦娜,糜漫天,王斌.不同膳食脂肪酸构成影响M NU诱导大鼠乳腺肿瘤发生的研究[J].营养学报,2006,28(03):247-251.
〔4〕 黄芳,黄子杰,陈洁,等.植物多酚类化合物抑制人乳腺癌MCF7/ADM细胞的筛选[J].实用肿瘤学杂志,2009,24(2):121123.
〔5〕 Xia SH,Wang JD,Kang JX.Decreased n-6/n-3 fatty acid ratio reduces the invasive potential of hum an lung cancer cells by down regulation of cell adhesion/invasion-related genes[J].Carcinogenesis, 2005,26(4):779-784.
〔6〕 Goodstine SL,Zheng TZ,Holford TR,et al. Dietary(n-3)/(n-6) fatty acid ratio:possible relationship to prem enopausal but not postm enopausal breast cancer risk in U.S.women[J].Nutr,2003,133 (5):1409-1414.
〔7〕 Leitzmann M F,Stam pferM J,Michaud D S,et al. Dietary intake of n-3 and n-6 fatty acids and the risk of prostate cancer[J].Am J Clinical Nutrition,2004,80(1):204-216.