甲基汞是一种具有神经毒性的环境污染物,主要侵犯中枢神经系统,可造成语言和记忆能力障碍等^〔1-2〕。其损害的主要部位是大脑的枕叶和小脑^〔3〕,其神经毒性可能与扰乱谷氨酸的重摄取和致使神经细胞基因表达异常^〔4〕有关。利鲁唑可能会抑制谷氨酸在突触前释放并能与受体结合阻止谷氨酸的激活^〔5〕,具有抑制甲基汞对大鼠的神经毒性和氧化损伤。本研究通过给大鼠注射利鲁唑,观察其大脑皮质汞、谷氨酸、谷氨酰胺、丙二醛含量,谷氨酰胺合成酶和磷酸活化的谷氨酰胺酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活力变化,以研究利鲁唑对甲基汞作用机制。

722型分光光度计(上海精密科学仪 器有限公司); 低温超速离心机(上海安亭科学仪器厂): F732 测汞仪(上海华光仪器仪表厂); 高速分散均质机( 上海标本 模型厂); 高速离心机( 上海医用分析仪器厂); KS-150 超声 波细胞粉碎机( 宁波科生仪器厂)。氧化甲基汞( 美国AIfaA esar公司); 利鲁唑(美国S igm a公司) ; 谷氨酸及谷氨酰胺 试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司); L-谷氨酰胺、 γ-谷氨酰羟胺酸、盐酸羟胺、三氯乙酸、二磷酸腺苷、乙二胺 四乙酸盐,Tffs、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、谷氨酸脱氢酶、L-谷 氨酸、5-5'-二硫对硝基苯甲酸、小牛血清白蛋白等。

清洁级W istar大鼠32 只[中国医科大学实 验动物中心,动物质量合格证号: SCXK( 辽) 2003-0009],体 重( 180 ± 10) g,雌雄各半。

正式实验前饲养7 d,按体重随机分 成4组: 对照组,低、高剂量氯化甲基汞组( 4,12 mm o l/kg )、 利鲁唑干预组,每组8只。对照组,低、高剂量染氯化甲基汞 组皮下注射生理盐水,利鲁唑干预组皮下注射利鲁唑211 35 μmol/kg 2 h后,对照组腹腔注射生理盐水,低、高剂量氯化甲 基汞组和利鲁唑干预组分别腹腔注射4,12,12 μmol/kg氯化 甲基汞溶液。共4周,周一~ 周五连续腹腔注射氯化甲基汞,每天一次( 共20 次); 周一、三、五给予利鲁唑干预(共12 次)。

最后一次注射后24 h,解 剖取脑,分离大脑皮质,测量大脑皮质汞含量,磷酸活化的谷 氨酰胺酶、谷氨酰胺合成酶活力,谷氨酸、谷氨酰胺、丙二醛含 量,超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活力改变。汞测 定用冷原子吸收法; 谷氨酰胺合成酶活力依据文献^〔6〕方法 进行测定; 磷酸活化的谷氢酰胺酶活力按文献^〔7〕方法测定; 谷氨酸和谷氨酰胺含量测定参照试剂盒说明书进行; 丙二醛 含量测定用硫代巴比妥酸比色法; 超氧化物歧化酶、谷胱甘肽 过氧化物酶活力测定分别用黄嘌呤氧化酶法和5-5'-二硫对 硝基苯甲酸比色法; 蛋白含量测定用Folin-Lowry法^〔8〕。

应用SPSS 111 5统计软件进行分析,多组间均数比较采用单因素方差分析,2组间均数比较用q 检验。

各组大鼠饮食和摄水量无明显差 别,单纯染12 μmol/kg 氯化甲基汞组有少量掉毛和出现稀样 便,有轻微中毒但无大鼠无死亡; 其他各组体征变化不明显,无中毒表现。随实验周数的增加而体重增加。染毒第2 ~ 4 周,12 μmol/kg氯化甲基汞组体重增长速度明显减慢,体重比 对照组降低,差异有统计学意义(P < 0.05,P < 0.01)。

表 1

表 1 各组大鼠大脑皮质汞及生化指标测定( x ± s, n= 8)

表 1 各组大鼠大脑皮质汞及生化指标测定( x ± s, n= 8)

从表 1可见,利鲁 唑干预组与高剂量氯化甲基汞组比较,汞、谷氨酸含量和磷酸 活化的谷氨酰胺酶活力明显降低,谷氨酰胺含量和谷氨酰胺 合成酶活力明显升高,差异有统计学意义(P < 0.01) 。

表 2

表 2 各组大脑皮质丙二醛含量与酶活力( x ± s, n= 8)

表 2 各组大脑皮质丙二醛含量与酶活力( x ± s, n= 8)

从表 2可见,利鲁唑干预组与高剂量氯化甲基汞组比较,丙二醛含量明显降低(P<0.01),超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活力明显升高(P<0.05,P<0.01)。

谷氨酸存在于谷氨酸-谷氨酰胺循环中^〔9〕,谷氨酰胺合成酶和磷酸活化的谷氨酰胺酶是谷氨酸能神经元的特异性标识物^〔10〕,扰乱谷氨酸-谷氨酰胺循环可导致谷氨酸代谢异常^〔11〕。本研究发现,大脑皮质汞、丙二醛含量升高,超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活力降低,表明氯化甲基汞可透过血脑屏障抑制抗氧化物质产生氧化损伤;谷氨酸、谷氨酰胺含最和谷氨酰胺合成酶、磷酸活化的谷氨酰胺酶活力改变,可能与甲基汞直接抑制2种酶活力及谷氨酸转运体功能有关,导致谷氨酸含量异常产生神经毒性。有研究发现,谷氨酸可诱导神经元Ca²⁺内流^〔12〕,Ca²⁺超载可刺激星形胶质细胞中产生活性氧^〔13〕。利鲁唑干预组与氯化甲基汞组比较,汞含量降低,可能由于干预后使其在体内重新分布或促进其排泄;而谷氨酸、谷氨酰胺含量和谷氨酰胺合成酶、磷酸活化的谷氨酰胺酶活力的改变,可能与降低汞对脑的直接损害有关,也可能与利鲁唑通过抑制谷氨酸释放或保护谷氨酸转运体功能有利于谷氨酸重摄取有关。利鲁唑的抗氧化作用,可能与减少汞对大脑直接损伤或调节谷氨酸代谢,缓解Ca²⁺超载及氧化损伤有关。