汉坦病毒(hantavirus,HV)属布尼亚病毒科汉坦病毒属,是肾综合征出血热(hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome,HFRS)和汉坦病毒肺综合征(hantaviruspulmonarysyndrome,HPS)的病原体。此病的传染源是带病毒的宿主动物,主要为啮齿类动物,每种基因型的HV有其主要的宿主动物,其中黑线姬鼠和褐家鼠分别携带汉滩型HV和汉城型HV,是主要宿主和传染源^{〔1, 2〕}。中国是受HV危害较为严重的国家。HFRS尚无有效特异性的治疗手段,对HFRS的预防和控制主要靠防护措施和灭活疫苗接种。目前HV灭活疫苗、减毒活疫苗的制备纯化工艺已较成熟,对控制HFRS的流行发挥了重要作用,但存在着抗原成分不纯、副反应多、毒株的毒力稳定性差、野生毒株污染和致癌等问题。汉坦病毒可以在低pH的条件下诱导细胞融合,但是对于其诱导细胞融合的位点却没有确切定论,明确其细胞融合作用对其预防及治疗具有重要作用。为此,国内外进行了大量相关研究。现将HV融合作用研究进展综述如下。

病毒锚定于包膜上的糖蛋白在受体识别和病毒通过与细胞膜融合进入目标细胞的过程中起重要作用。与受体绑定之后,汉坦病毒通过受体介导的网格蛋白依赖的内吞作用进入细胞,而且汉坦病毒被认为在pH<613的时候才会与包涵体膜融合。OginoM等也通过试验证实,感染的VeroE6细胞只在低pH条件下形成合胞体,而在中性pH时不能发生融合。

RichardM等认为病毒的膜融合蛋白活性中心是由融合肽构成的,正是融合肽推动了最初的融合蛋白与目标膜的区分以及随后双层结构的破坏^〔3〕。在高分辨率X光衍射数据的基础上,人们发现了2类融合蛋白。一类融合蛋白由几种不相关病毒家族的融合蛋白组成,在它们之中有流感病毒血凝素,免疫缺陷病毒gp41,副粘病毒F蛋白以及埃博拉病毒的GP2。它们共同的特征性结构包括一个与N端定位的膜融合单元邻近的三聚卷曲螺旋折叠,而这个卷曲的螺旋折叠是由含a螺旋构象的氨基酸组成的。与此相对的二类融合蛋白则通过3个反相平行的B-折叠结构域来区分^〔4〕,其包含一个由2个侧面相接的B-折叠构成的内部融合肽^〔5〕。甲病毒E1和黄病毒E蛋白已经被确认为是二类融合蛋白,分属于披膜病毒科和黄病毒科。尽管这2种融合之间有区别,融合肽却在理化以及拓扑参数上有许多共同点,例如在病毒家族中的高度保守序列,一个长度为15~25的残基,一个定位于包膜蛋白胞外结构域以及富含Gly残基^〔3〕。

NicoleDTischler等^〔6〕通过汉坦病毒以及相关种属的Gc包膜糖蛋白来识别确定融合肽的候选序列,并且,他们构建了一种源自Gc胞外结构域的三位分子模型来研究汉坦病毒Gc包膜糖蛋白与二型融合蛋白折叠是否具有兼容性,从而来推测汉坦病毒的融合类型。根据其研究结果,汉坦病毒Gc糖蛋白上Cys残基位置与二类融合肽上的Cys残基位置相符合。其构建的三维模型给出的结果也支持了汉坦病毒Gc蛋白含有B-折叠这个观点,并且汉坦病毒Gc蛋白与二类融合蛋白在疏水性剖面以及二级结构上有很强的对应性^〔6〕。总之,其研究结果对汉坦病毒融合属于二类融合这个假设提供了强有力的支持,并且其融合肽区域可能是ANDVGc第115~129位氨基酸残基。

编码糖蛋白(GP)的M片段mRNA(长3.6kb)通过一个连续的开放性阅读框架(ORF),编码一条高甘露糖型GP前体(GPC),M段不编码非结构蛋白。GPC在内质网初级糖基化后,经切割裂解成Gn、Gc糖蛋白,进而在高尔基体内完成糖基化。所有的HVG1糖蛋白C一末端都有1个相同的保守性氨基酸(aa)序列:WAASA,是GPC裂解信号,在细胞内信号肽酶介导下使GPC断裂为Gn和Gc,形成异二聚体,保守序列的最后1个丙氨酸(A)残基是该信号序列的信号酶位点^〔7〕。

尽管详细机制仍然不清楚,但是许多有包膜并会导致病毒膜与细胞膜融合的病毒都通过 包膜上GP与细胞膜之间的相互作用^〔8〕。并且,大家都普遍 接受GPs与细胞膜上相对应的特异受体相绑定是病毒膜与 细胞膜之间建立密切联系的重要步骤这个观点。根据这个观 点,GPs上特定的区域与细胞膜相作用,伴随或不伴随GPs构 象的变化,膜融合作用开始进行。

Nicole D Tischler等^〔6〕研究结果支持汉坦病毒以及布尼亚病毒科的其他成员Gc糖蛋白有直接的病毒融合活性假设,并且,它可能被分类为二类病毒融合蛋白。

MichikoOgino等^〔9〕通过另一种方法证实了GP具有融合活性。其使用感染以及转染的VeroE6细胞来证明汉坦病毒GP蛋白具有融合剂活性。这种融合活性是不依赖其他的病毒成分以及病毒复制的。结果提示,无论是表面输送的GP蛋白还是GP蛋白介导的细胞融合都具有细胞依赖性。在其实验中,清楚地展示了在低pH条件下,汉坦病毒感染的细胞融合在一起,而且,将感染与未感染细胞共培养之后发现,感染细胞与未感染细胞之间可以融合,并且与感染细胞之间的融合有相同的融合效率。其使用流式细胞仪以及荧光抗体分析法检测到GPs在细胞的表面定位。在该研究中,其首次通过在转染的Vero细胞中表达重组的GPs蛋白介导了pH依赖性的细胞融合,这是第一个汉坦病毒GPs蛋白是融合剂的直接证据。并且,对G1和G2的中和性单抗抑制了细胞融合现象的出现,而对G1和G2非中和性但对衣壳蛋白(NP)有中和性的单抗却无法抑制融合现象的产生。表明细胞表面的汉坦病毒GPs有融合剂的作用。

N-联寡糖链可以 在很多方面影响蛋白的功能,如促进它们正确折叠、维持蛋白 的构型和稳定性、保护蛋白免受蛋白溶解作用、调控蛋白的生 物学活性。有报道显示,某些病毒融合蛋白的寡糖链缺失可 使病毒的细胞融合功能缺陷或丢失^{〔10, 11〕}。汉坦病毒包膜糖 蛋白Gn和Gc是通过N-联糖基化作用来修饰的。汉坦病毒 GPs包含5 个N-联糖基化位点,其中的4 个位于Gn 上 ( N134,N235,N347,N399 ),而另外一个位于Gc 上 ( N928) ^〔12〕。

XiaohongShi等1132研究了Gn上N-联糖基化位点在蛋白折叠中的作用发现,N134位点对蛋白的正确折叠有重要作用,其他位点的单独突变则对蛋白折叠无重大影响。但是在N235和N399位点上的联合突变会导致Gn蛋白的错误折叠。并且内质网伴侣蛋白calnexin和钙网蛋白在汉坦病毒糖蛋白的折叠中起重要作用,验证了汉坦病毒N-联糖基化位点在蛋白折叠以及胞内运输中起重要作用。而FengZheng等^〔14〕进一步验证了汉坦病毒包膜糖蛋白上的N-联糖基化位点对细胞融合是必要的。

明确细胞膜上与病毒相对应的受体是搞清病毒感染过程中的重要一步。人类的出血性疾病大都与整合素Avβ3相关,致病性的汉坦病毒掌控了AvB3的功能从而导致急性血管疾病^〔15〕。体外试验提示,整合素受体Avβ3是汉坦病毒侵入上皮细胞的受体。但是在活体细胞中B3是不是汉坦病毒唯一的受体尚不确定。SongJW等^〔16〕用新生乳鼠构建了汉坦病毒感染模型。实验中,乳鼠平均在感染汉坦病毒后14d左右死亡,对应β3的特异性单抗将乳鼠的平均生存期延长到了1917d左右(P<0101),同时,对应B1的单抗也将乳鼠的平均生存期延长到19d左右,结果显示,整合素受体B3以及B1在汗坦病毒感染活体细胞的过程中起重要作用;同时提示,汉坦病毒在感染器官过程中有其他的受体。

细胞融合是包括HV在内的许多包膜病毒侵入细胞、复制、释放、传播和致病的重要生物过程,也是细胞间信息传递的重要步骤,是决定病毒毒力的重要因素。融合蛋白介导的细胞融合是包膜病毒侵入宿主细胞的最为重要的步骤。可能存在融合肽的G2片段应会成为研制基因疫苗的热点。武汉第一医院的HuangHao等^〔17〕将白介素2与汉坦病毒G2片段连接起来构建了一种新的嵌合式质粒疫苗,并对它能否成为一种可用的疫苗进行了测试。结果显示,该质粒疫苗能同时介导特异性针对HTNVG2的体液和细胞免疫应答。这项研究为汉坦病毒新型疫苗的研制提供了新的思路。因此,明确HV的细胞融合机制,尤其是精确的细胞融合活性位点功能定位,对更有效地研制新型疫苗和治疗制剂,用于HFRS、HPS的预防和治疗具有重要意义。