Aptame rs一词源于拉丁文Aptus,意即适合,故译为适体,由E lling tin等于1990年首次提出^〔1〕,是体外人工合成具有确定二级或三级结构的单链DNA或RNA寡核苷酸分子。通过指数富集配基的系统进化技术(systematic evo lution of ligands by exponential enrichment,SELEX)可从随机寡核苷酸库中筛选出针对任何靶分子的适体。目前已经发现的靶分子很广泛,包括细菌、病毒和寄生虫等,这些病原体在一定条件下可以感染人类,从而导致各种相关疾病。以病原体及其代谢产物为靶物质,筛选得到的适体可以特异性识别和结合靶物质,并在一定程度上具有抑制病原体感染的作用,从而为感染性疾病的治疗提供了一种新的选择。另外,适体还可以用于病原体的检测,这对于病原体引起的相关疾病的预防和治疗具有一定意义。本文对适体在病原体感染所致疾病的检测和治疗中的应用研究进展综述如下。

随着生物科学技术的发展,人们逐渐认识到DNA和 RNA不仅是遗传信息储存和传递的载体,还可以通过自身折叠形成特殊的空间结构与其他类型的分子相互作用,结合或封闭靶物质的活性表位,从而阻断其生物功能,达到治疗疾病的目的^{〔2, 3〕}。适体相对于抗体具有许多明显的优势:(1)适体的产生不需要利用动物,其筛选完全在体外进行,不涉及任何动物和细胞;(2)抗体在体内产生,也就是动物免疫系统选择靶蛋白的表位产生了与之结合的抗体。体内参数限制了抗体的识别,抗体只有在生理条件下识别靶物质,限制了延伸抗体的功能和应用。而适体选择制备过程能够通过调节与靶物质特定结合部位,而获得相应的适体;(3)适体的结构简单,适体型感受器板层(aptam er-based senso r Layers)比抗体型板层(antibody-based layers)更容易再生适体。另外,抗体蛋白的异源性很难克服,但至今未有资料显示适体具有任何免疫原性或毒性。适体已经被广泛应用于蛋白分析、靶标确认、药物开发,甚至直接用于临床治疗。

感染性疾病的发生主要与病原体的侵袭力和宿主的抵抗力有关。而由于抗生素的大量使用,体内的条件致病菌和耐药菌逐渐增多,导致人体感染的风险加大。临床上需要新的快速检测和诊断病原体感染的方法,以利于疾病的预防和早期治疗。适体用于检测病原体的模式有三明治夹心法、适体芯片、适体传感器和斑点印迹法等。

全球丙肝患者大约有11 7亿,是一种严重威胁人类健康的传染病。目前检测丙肝病毒感染的主要方法是基于抗体的酶连免疫吸附法,但是在丙肝病毒感染的早期,机体内没有产生针对病毒的抗体,故该方法不适用于疾病早期的检测诊断。Lee等^〔4〕报道了一种可以早期检测丙肝病毒的适体芯片技术,适体9-14,9-15是经过9轮筛选得到的RNA序列,实验证实它们均可以特异性识别和结合丙肝病毒的核心抗原,且解离常数均在纳摩尔以内。另外,检测临床病人的血清标本,结果也证实了基于特异性适体检测实际标本具有可行性。因此,这种基于适体的模式可以用于早期检测丙肝病毒感染,有利于丙肝的早期发现和治疗。

土拉热弗朗西丝菌是一种有荚膜的革兰阴性的球杆菌,常常由感染的啮齿类动物传播并导致人类患病,进一步侵犯人体内巨噬细胞、肝细胞等相关细胞。Vivekananda等152以灭活的整个细菌作为靶物质,构建了包含42个随机核苷酸的DNA文库,经过10轮筛选获得了25个不同序列的适体,并以这些筛选出来的适体为基础,建立了检测土拉热弗朗西丝菌的适体连结固定吸收方法。首先将特异性的适体加入酶标板的孔中,使其结合在酶标孔表面,再加入灭活细菌使其与适体结合,然后加入生物素化适体,最后加入链亲和素连接的辣根过氧化物酶催化底物显色。该方法最低可以检测细菌的浓度为1.7×10³/mL,这显然达到了临床检测细菌感染的水平。另外,他们还采用了斑点印迹法证实了该适体具有很好的特异性。因此,以上2种基于适体的方法对于细菌的检测很有效率,并将对相关疾病的预防和控制起到一定作用。

鸟型分枝杆菌是一类细长略带弯曲的杆状细菌,属于缓慢生长的致病菌种。该菌感染人类引起的相关疾病被称为Johne.sdiseaes (JD),每年由该病治疗所花费的金额高达2亿美元。Radosev ich等162构建了一个包括40个随机核苷酸的DNA文库,以麦芽糖结合蛋白为靶物质,经过12轮筛选得到了适体43,93和94。实验证明,这些适体具有很好的识别和结合鸟型分枝杆菌的能力,没有检测到交叉反应,特异性明显优于单克隆抗体,并且其结合未变性靶蛋白的能力明显强于变性后的靶蛋白。说明这些适体具有很好的特异性,可以达到临床检测的要求。实验中使用了免疫印迹法和斑点印迹法这2种模式不仅可以探明适体的结合特性,而且还可以作为一种常规的检测病原体的方法。常规的分枝杆菌培养难度大,而且费时,不利于细菌的快速诊断和鉴定。

Ramos等^〔7〕构建了一个包含76个核苷酸的单链DNA文库,并以纯化的利斯曼原虫蛋白抗原作为筛选靶物质,仅经过3轮筛选便得到富集DNA适体库。混合适体能够识别和结合利斯曼原虫蛋白抗原,并通过酶连寡核苷酸测试、斑点印迹法和蛋白印迹分析3种方法证明该适体具有很好的特异性和亲和力。混合适体与靶蛋白反应时,背景干扰小,而且目前尚未有针对抗原的商品化抗体出现。由此可见,这些适体可以作为一种新的检测手段用于利斯曼原虫的检测和诊断。但值得注意的是,适体是在一定的外界环境下产生的,离开了特定的环境其特性可能会发生一些改变,很可能会影响到其结合能力,从而影响到对实际环境中的靶物质的检测效率。

目前,适体作为一种新的药物,少数已经进入了临床实验阶段^〔8〕。适体早期的主要问题是稳定性不理想,经过稳定性处理的适体通过静脉注射和皮下注射的血液半衰期在6~ 12 h。适体分子量和体积小,易于进入细胞内,合成成本低,批次间的差异也很小,在药物开发方面具有广阔前景。

Jo sh i等^〔9〕用H IV-1逆转录酶(rev erse transcr iptase,RT)作为靶分子分离出能够特异性结合H IV-1 RT,并能抑制H IV病毒复制的RNA适体。实验证实,在体外和细胞培养中该适体均能够使病毒的复制减少90%~99%,并在人类免疫缺陷病毒感染的293 T细胞中稳定表达了一种能抑制H IV-1逆转录酶活性的RNA适体,成功阻断了H IV-1的逆转录过程,从而有效地抑制病毒感染。Jay等^〔10〕以RT为靶物质筛选到了单链的DNA适体,该适体对病毒的半抑制浓度和平衡解离常数值均可在纳摩尔以内。实验证实,使用该适体后可以有效减少病毒感染率,并且对病毒亚种和耐药菌株也有效。Fabien等^〔11〕针对人类免疫缺陷病毒1型的The trans-activating responsive (TAR)序列筛选到了RNA适体,为了让适体更适合体内环境,对其结构进行了改造。铆定核苷酸(LNA)是由 RNA适体改造形成的,LNA是在2'位氧和4'位碳之间连接了一个亚甲基,从而使核糖的弹性受到限制,提高了核酶的耐受能力和对TAR茎环结构的亲和力。改造后的适体也能特异性的与TAR结合,抑制病毒活性,并且改造后的DNA和LNA适体更加适应体内环境,为临床用药奠定了基础。

SARS是一种由新型冠状病毒(SAR-SCV)感染所致的急性呼吸道传染病,由于传染性强,进展迅速,具有较高的病死率,曾经在世界范围内对人类健康构成严重威胁。Jang等^〔12〕针对SCV NTPase /H e licase这一新的靶点,经过15轮的筛选得到富集文库,并且筛选出的RNA适体可以有效的抑制病毒解螺旋酶的活性,而对三磷酸腺苷酶的活性影响很小。实验证明,适体抑制解螺旋酶的链能力具有明显的剂量依赖性,其对解螺旋酶的有效半抑制浓度为01 035 ng/LL,由此可见,适体抑制病毒的效率很高。解螺旋酶是病毒复制所必需的酶,抑制了它的活性就能有效的抑制病毒的感染,从而达到预防和治疗传染性非典型性肺炎的作用。值得注意的是适体通常是在严格的筛选环境下产生的,而人体内环境中的成份相当复杂,如何才能将其有效的应用于体内治疗是当前主要面临的难题之一。

Cheng等^〔13〕以甲型流行性感冒病毒亚型5的蛋白为靶物质,通过11轮筛选得到了高亲和力的DNA适体10。结果显示,该适体具有很强地结合病毒蛋白的能力,并且可以有效的抑制该型流感病毒感染狗肾细胞(MDCK),从而阻止病毒侵入细胞。由此可见,该适体可以有效延缓病毒感染机体,这有利于帮助机体内的免疫系统识别病毒并发生免疫反应。Jeon等^〔14〕也筛选出了能够封闭流感病毒受体结合域,从而抑制病毒感染的DNA适体。适体的一大优势便是可以与任何感兴趣的作用靶点互相作用,极大的拓展了药物的开发利用。下一步研究工作的重点应该是逐步建立起适体用于抑制病毒复制感染的动物模型,并最终应用于人体内的疾病治疗。

Fukuda等^〔15〕筛选到了针对丙型肝炎病毒非结构蛋白编码区3(NS3)的RNA适体。结果显示,该适体能够抑制NS3编码蛋白的90%的蛋白水解酶活性,而且在体内能够抑制麦芽糖结合蛋白-NS3(MBP-NS3) 70%的蛋白水解酶活性。N ish ikaw a等^〔16〕构建了以质粒为载体的人D型肝炎病毒(HDV)核酶和适体G9-Ò的复合体 (HA),然后转染H ela细胞使其表达G9RNA适体。HDA核酶将复合体转录的G9 RNAs加工成G9-Ò适体分子,加工后的适体分子能抵抗核酸内切酶的作用,稳定性得到了很大增强,并且转染后保持活性达4 d以上。另外,引入的相关元件(巨细胞病毒增强子+鸡B-肌动蛋白-球蛋白启动子)能诱导这个复合体在细胞中持续的表达适体。该适体的NS3蛋白酶活性抑制作用也得到了证实,这也为在细胞中表达有功能活性的适体提供了可能,极大地加快了适体用于体内治疗的进展。

朊病毒可以引起人和动物传染性海绵状脑病,导致致死性中枢神经系统慢性退化。尽管该病的发病率很低,但是其造成的后果相当严重,预后不良。K ing等^〔17〕以纯化的朊病毒蛋白质作为靶物质,然后用放射性磷标记的DNA作为起始文库,由此筛选的适体稳定性不会因改造受到影响。结果显示,适体97具有最高的亲和力,可以在脑组织匀浆中特异性地识别和结合朊病毒蛋白质。值得注意的有2个方面:一是适体97与病毒蛋白结合后是否影响到蛋白的正常构型,从而抑制病毒的活性;另外该适体能否有效地穿越血脑屏障,到达脑组织中与病毒蛋白质结合,还有待深入研究。

委内瑞拉脑炎病毒可以感染人类,严重威胁到人类健康。但至目前为止,尚未开发出有效的治疗药物。近年来研究发现,病毒的衣壳蛋白可以作为一种潜在的治疗靶点,抑制了该位点就可能抑制病毒的组装,从而达到抑制病毒感染的效果。Kang等^〔18〕以委内瑞拉脑炎病毒的衣壳蛋白作为靶物质,筛选到的RNA硫适体16-1对靶蛋白具有很高的特异性和很好的亲和力(7 nm o l/L)。实验证实,适体的3级结构对于靶蛋白的识别和结合至关重要。但是关于经硫改造的适体如何增强与靶物质的结合力,研究报道较少。因此,要将体外筛选到的适体应用到体内的疾病治疗还需要大量的实验研究。

目前大多寄生虫病的治疗都不是很有效,且药物毒副作用大,药效难以持久,药物开发进展缓慢。适体依赖其特定的3级空间结构与靶物质紧密地结合,有望作为核酸药物取低小分子化合物,用于寄生虫病的治疗。非洲布氏锥虫是人与家畜易感的致命的寄生虫病,目前所使用的药物毒副作用大,且存在耐药现象。Hmm ann等^〔19〕构建了85个核苷酸的RNA序列文库,得到了3个家族的抗布氏锥虫适体。其中,适体2~16能折叠形成假结发夹结构并能够与血流阶段的抗布氏锥虫结合,亲和力达到60 nm o l/L。这不仅为治疗寄生虫提供了可行的方法,还为适体用于活组织或其他复合物表面成分的鉴定及定位提供了基础依据。

近年来适体技术发展迅猛,相关技术层出不穷,无论是在疾病的诊断,还是在疾病的治疗方面均取得了一定成果^〔20〕。适体已经被广泛应用于基因调控、分析化学、疾病治疗、临床诊断和药物筛选等方面,显示出广泛的应用前景。尤其是当抗体受限于分子量、免疫原性,稳定性时,适体便表现出优越性。另外适体分子量适中,既能有效的接近抗体无法靠近识别的靶位又能与靶物质紧密结合,其最明显的优势是可以在不明确靶物质表面结构和结合表位的情况下与之结合,并能有效抑制其活性,极大的拓展了适体的使用范围。尽管目前还无有关适体毒副作用的报道,但对于各种修饰性适体的安全性和有效性仍需进一步研究证明。今后研究的工作重心在于探讨适体与其靶物质的结合对于机体可能产生的各种调节作用。随着相关研究的深入,适体技术将会在病原体引起的各种相关疾病的诊断和治疗方面发挥重要作用。